植物基因型快速鑒定試劑盒，即BeyoPlant™ Rapid Plant Genotyping Assay Kit植物樣品直接PCR預(yù)混液(2X)，提供了一種使用特別便捷的all-in-one的2倍濃度的檢測(cè)試劑，加入一小塊植物葉片等柔嫩的組織和適量的引物和水，就可以直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，后續(xù)直接電泳觀察結(jié)果就可以判斷植物的基因型了。本產(chǎn)品不僅可以用于植物的基因型鑒定，也可以用于其它適當(dāng)用途的植物樣品的直接PCR檢測(cè)，可以輕松完成長(zhǎng)度達(dá)到5kb的DNA片段的擴(kuò)增。

本試劑盒提供了可專門用于植物樣品的2倍濃度的PCR預(yù)混液，并且PCR結(jié)束后可以直接上樣電泳無需添加上樣緩沖液。本產(chǎn)品含有耐葉綠素的PlantTaq™ DNA聚合酶，這是一種經(jīng)過基因工程改造的非常高效的適用于植物樣品直接PCR檢測(cè)的耐熱DNA聚合酶。

對(duì)于植物葉片等柔嫩樣品可以直接PCR檢測(cè)，無須提取DNA。本產(chǎn)品對(duì)玉米、絲瓜、甜椒、豆角、黃豆、辣椒、黃瓜、茄子、番茄等植物樣品中的葉綠素、多糖、多酚等各種PCR抑制劑表現(xiàn)出超強(qiáng)的抗性，對(duì)于新鮮采集的、4℃保存或低溫凍存的這些植物的葉片、嫩種子等，都無需進(jìn)行DNA提取純化，可以直接用于PCR擴(kuò)增目的DNA。

所需樣品少，耐受能力高。本產(chǎn)品用于20μl的PCR擴(kuò)增體系時(shí)，通常僅加入0.1-1mm直徑葉片即可順利完成PCR檢測(cè)。

本產(chǎn)品提供了一對(duì)陽性對(duì)照引物，便于確認(rèn)PCR檢測(cè)效果。該對(duì)引物是多種植物的通用引物，可以擴(kuò)增多數(shù)植物葉綠體中高度保守的IRB18基因的297bp DNA片段。

本產(chǎn)品用于植物葉片檢測(cè)的效果參考圖1。圖中可見，本產(chǎn)品對(duì)多種常見植物葉片都有很好的PCR擴(kuò)增效果。

圖1. 植物基因型快速鑒定試劑盒檢測(cè)圖中所示不同植物葉片中目的基因的實(shí)測(cè)效果圖。使用BeyoPlant™植物基因型快速鑒定試劑盒中提供的Easy-Load™ Plant Direct PCR Master Mix (2X)和Control primer mix，在PCR體系中直接加入不同植物葉片，用于擴(kuò)增IRB18基因的297bp DNA片段后的電泳效果圖。M, DNA marker (D0110 DNA Ladder (0.2-12 kb, 12 bands))；1, 豆角(Cowpea)；2, 黃豆(Soybean)；3, 絲瓜(Sponge gourd)；4, 甜椒(Capsicum)；5, 玉米(Maize)；6, 黃瓜(Cucumber)；7, 辣椒(Pepper)；8, 茄子(Eggplant)；9, 番茄(Tomato)。

本產(chǎn)品擴(kuò)增不同長(zhǎng)度目的基因的效果參考圖2。圖中可見，本產(chǎn)品以番茄葉為模板可直接PCR擴(kuò)增出長(zhǎng)達(dá)5kb的DNA片段。

圖2. 植物基因型快速鑒定試劑盒直接以番茄葉片為模板擴(kuò)增不同長(zhǎng)度的目的基因的效果圖。M, DNA marker (D0110 DNA Ladder (0.2-12 kb, 12 bands)); 1, IRB18(297bp)；2, actin(693bp)；3, rbcL(1201bp)；4, rpoC2(2069bp)；5, rpoC2(3079bp)；6, rpoC2(3942bp)；7, rpoC2(5000bp)。

本產(chǎn)品擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物帶有3'-dA overhangs的粘性末端，可直接用于和T載體連接進(jìn)行TA克隆。

用途：植物葉片等比較柔嫩的組織樣品基因組DNA中目的基因的直接擴(kuò)增、基因分型(如基因缺失等)，以及基因敲除或轉(zhuǎn)基因植物基因型分析。

失活或抑制：酚氯仿抽提可以使Easy-Load™ Plant Direct PCR Master Mix (2X)中含有的PlantTaq™ DNA Polymerase失活。

本產(chǎn)品如果用于50微升的PCR反應(yīng)體系，兩種包裝的本產(chǎn)品分別足夠用于40個(gè)和200個(gè)反應(yīng)；如果用于20微升的PCR反應(yīng)體系，兩種包裝的本產(chǎn)品分別足夠用于100個(gè)和500個(gè)反應(yīng)。

包裝清單：

保存條件：

-20℃保存。適當(dāng)避免反復(fù)凍融。

注意事項(xiàng)：

由于PCR反應(yīng)非常靈敏，在使用本產(chǎn)品時(shí)請(qǐng)注意避免微量待擴(kuò)增DNA的污染，并盡量考慮設(shè)置不加模板的空白對(duì)照以確認(rèn)是否有待擴(kuò)增DNA的污染。

設(shè)置PCR反應(yīng)體系時(shí)，20μl和50μl PCR體系中植物樣品的推薦用量分別為0.1-1mm和0.3-3mm直徑葉片或類似大小其它比較柔嫩的植物組織，可以直接添加到PCR體系中，無需進(jìn)行任何額外處理。經(jīng)測(cè)試本產(chǎn)品適用于柔嫩新鮮種子的直接PCR，但不適用于干硬種子的直接PCR。

PCR反應(yīng)結(jié)束之后，酌情3000-5000g離心3-5min以沉淀植物組織碎片，便于吸取上清用于電泳分析等。

需自備Nuclease-Free Water。推薦選購ST876 BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile)。

本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.PCR反應(yīng)體系的設(shè)置：
a.融解并混勻試劑盒中的Easy-Load™ Plant Direct PCR Master Mix (2X)和Control primer mix (10μM each)，置于冰浴上或冰盒內(nèi)。
b.參考下表在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)體系：

注意：
(a)模板使用量：作為PCR模板的植物組織用量，對(duì)于20μl和50μl PCR反應(yīng)體系，植物樣品的推薦用量分別為0.1-1mm和0.3-3mm直徑葉片或類似大小其它比較柔嫩的植物組織。如果模板為植物種子，盡量使用鮮嫩的植物種子。用干凈的解剖刀去掉種子外殼，剪下直徑約0.5-2mm的組織直接放入PCR管內(nèi)；若種子太小，如番茄種子，可直接使用1-2粒完整的種子放入PCR管內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增。50μl PCR體系，植物葉片或是種子直徑不宜超過3mm，太多模板易造成PCR抑制成分偏多，影響PCR效果。推薦取兩份植物組織樣品進(jìn)行平行的PCR實(shí)驗(yàn)，以降低取樣的不穩(wěn)定性。為確保取樣的均一性，建議使用專用的打孔器或解剖刀進(jìn)行取樣，并注意防止取樣過程中的交叉污染。每一次取樣，可以用2%的次氯酸鈉溶液清洗打孔器或解剖刀。對(duì)于高GC含量的PCR擴(kuò)增，可以嘗試向PCR體系中加入終濃度1-10% (體積百分比)的DMSO。
(b)引物濃度：通常引物的終濃度為0.5μM時(shí)可獲得良好的檢測(cè)效果，也可以根據(jù)情況在0.1-1.0μM范圍內(nèi)調(diào)整引物的終濃度。擴(kuò)增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，可降低引物濃度。
c.用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體和待檢測(cè)植物組織積聚于管底。
d.如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果PCR儀沒有熱蓋，則在管內(nèi)滴入一滴礦物油(ST275 Mineral oil (礦物油))。
e.把設(shè)置好的PCR反應(yīng)體系置于PCR儀上，開始PCR反應(yīng)。
2.PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置可以參考如下表格：

注意：
a.起始變性(94℃，5min)可以使植物組織樣品裂解，釋放出可用于PCR擴(kuò)增的基因組DNA。
b.需根據(jù)每次反應(yīng)的模板、引物、PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度和GC含量等適當(dāng)優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，包括溫度、時(shí)間和循環(huán)數(shù)等。
c.對(duì)于初次進(jìn)行的PCR，為盡量確�？梢詳U(kuò)增出預(yù)期的PCR產(chǎn)物，可以把循環(huán)數(shù)設(shè)置為35。
常見問題：
1.PCR產(chǎn)物非常少或沒有特異性條帶。
a.引物設(shè)計(jì)不佳是PCR過程中最常見的問題。請(qǐng)選擇適當(dāng)?shù)囊�物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，注意引物的GC含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長(zhǎng)度、特異性等方面的問題。在加入酶切位點(diǎn)等的引物中，一定要注意加入酶切位點(diǎn)等后整條引物的GC含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長(zhǎng)度、特異性等方面的問題。在原有引物效果不佳的情況并且陽性對(duì)照引物可以正常工作的情況下，可以考慮更換引物。
b.待擴(kuò)增片段GC含量偏高。向PCR體系中嘗試加入適合擴(kuò)增高GC含量DNA片段的試劑。
c.目的片段過長(zhǎng)。盡管PlantTaq™ DNA Polymerase可以擴(kuò)增最長(zhǎng)達(dá)5kb的DNA片段，但大多數(shù)時(shí)候更適合擴(kuò)增2-3kb以下的片段。對(duì)于過長(zhǎng)的目的片段的擴(kuò)增，需要適當(dāng)優(yōu)化引物和PCR反應(yīng)參數(shù)。
d.引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)、引物二聚體或引物偏短會(huì)導(dǎo)致退火效果不佳。此時(shí)可以采用Touch down等方法進(jìn)行退火，通常采用從65℃逐步緩慢降溫到55℃或50℃的方法，使退火更加充分。
e.退火溫度不佳，需要優(yōu)化。如果有溫度梯度PCR儀，則可以設(shè)置退火的溫度梯度，摸索退火的最佳溫度。如果沒有溫度梯度PCR儀，則可以通過多次PCR反應(yīng)摸索最佳的退火溫度。
f.延伸時(shí)間不足�？砂凑彰�1kb片段延伸2分鐘進(jìn)行設(shè)置，對(duì)于較難擴(kuò)增的片段可以設(shè)置為每1kb片段延伸3-4分鐘。
g.在不同PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，避免有時(shí)PCR儀出現(xiàn)問題。
h.循環(huán)數(shù)不足，適當(dāng)延長(zhǎng)PCR的循環(huán)數(shù)。通常循環(huán)數(shù)最高不必超過40，常用的循環(huán)數(shù)范圍為30-40。
i.模板用量偏少，可以在耐血體積范圍內(nèi)適當(dāng)加大樣品用量，或采用巢式PCR (nested PCR)或二次PCR。巢式PCR即為在原先設(shè)計(jì)的PCR引物內(nèi)側(cè)再設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，然后對(duì)第一次PCR產(chǎn)物進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，這樣一方面可以起到擴(kuò)增作用，同時(shí)也可以從第一次PCR產(chǎn)物中擴(kuò)增出特異性條帶。二次PCR則為比較簡(jiǎn)單地用原有引物對(duì)第一次PCR產(chǎn)物進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，可以起到擴(kuò)增作用，但不能去除非特異性條帶。
j.對(duì)PCR引物進(jìn)行脫鹽甚至PAGE膠或HPLC純化。
k.當(dāng)產(chǎn)生較多非特異性條帶時(shí)，可以適當(dāng)提高退火溫度。
l.注意設(shè)置適當(dāng)?shù)年栃詫?duì)照和陰性對(duì)照通常會(huì)對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷有很大幫助。
2.雜帶較多或條帶彌散
a.退火溫度提高 2-5℃。
b.減少植物組織樣品的用量。
c.在室溫配制PCR體系容易產(chǎn)生非特異性條帶。推薦在冰浴上配制PCR反應(yīng)體系。
d.如果模板的GC含量過高，需要考慮加入適合擴(kuò)增高GC含量DNA片段的試劑。
e.適當(dāng)縮短延伸時(shí)間。​