Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit)是用FITC標(biāo)記的重組人Annexin V來檢測細(xì)胞凋亡時出現(xiàn)在細(xì)胞膜表面的磷脂酰絲氨酸的一種細(xì)胞凋亡檢測試劑盒。可以使用流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡或其它熒光檢測設(shè)備進(jìn)行檢測。

Annexin是一類廣泛分布于真核細(xì)胞細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。但僅Annexin V被報道可以調(diào)控一些PKC的活性。
Annexin V選擇性結(jié)合磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，簡稱PS)。磷脂酰絲氨酸主要分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，即與細(xì)胞漿相鄰的一側(cè)。在細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期，不同類型的細(xì)胞都會把磷脂酰絲氨酸外翻到細(xì)胞表面，即細(xì)胞膜外側(cè)。磷脂酰絲氨酸暴露到細(xì)胞表面后會促進(jìn)凝血和炎癥反應(yīng)。而Annexin V和外翻到細(xì)胞表面的磷脂酰絲氨酸結(jié)合后可以阻斷磷脂酰絲氨酸的促凝血和促炎癥反應(yīng)活性。
用帶有綠色熒光的熒光探針FITC標(biāo)記的Annexin V，即Annexin V-FITC，就可以用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡非常簡單而直接地檢測到磷脂酰絲氨酸的外翻這一細(xì)胞凋亡的重要特征。
本試劑盒還提供了碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)染色液，碘化丙啶可以染色壞死細(xì)胞或凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞，呈現(xiàn)紅色熒光。對于壞死細(xì)胞，由于細(xì)胞膜的完整性已經(jīng)喪失，Annexin V-FITC可以進(jìn)入到細(xì)胞漿內(nèi)，與位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，從而也使壞死細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。
本試劑盒的流式檢測效果參考圖1和圖2，熒光顯微鏡檢測效果參考圖3。

圖1.細(xì)胞用本試劑盒染色后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的效果圖。Jurkat細(xì)胞未經(jīng)處理(A)或用10μM喜樹堿(Camptothecin)作用4小時(B)后，用本試劑盒染色，然后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞的散射和熒光檢測。從圖中可以看出，經(jīng)過凋亡誘導(dǎo)劑喜樹堿處理后的細(xì)胞，其Annexin V-FITC染色陽性并且PI染色陰性的細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞，明顯增加(B圖的右下象限)，Annexin V-FITC和PI染色雙陽性的細(xì)胞，即壞死細(xì)胞，也有所增加(B圖的右上象限)。圖中Annexin V-FITC染色陰性PI染色陽性(Annexin V-/PI+)所在象限(A和B圖的左上象限)出現(xiàn)的細(xì)胞點是許可范圍內(nèi)的檢測誤差。實測數(shù)據(jù)可能會因細(xì)胞類型、細(xì)胞凋亡情況、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

圖2.細(xì)胞用本試劑盒染色后流式細(xì)胞儀檢測效果驗證圖。Jurkat細(xì)胞用10μM喜樹堿(Camptothecin)作用4小時后，未經(jīng)染色(A)、僅用本試劑盒中的PI進(jìn)行染色(B)、僅用本試劑盒中的Annexin V-FITC進(jìn)行染色(C)、用本試劑盒中的Annexin V-FITC和PI進(jìn)行雙染(D)。從圖中可以看出，未經(jīng)染色的是雙陰性細(xì)胞(A)，僅PI染色后出現(xiàn)了預(yù)期的PI染色陽性的細(xì)胞，僅Annexin V-FITC染色出現(xiàn)了預(yù)期的Annexin V-FITC染色陽性的細(xì)胞，Annexin V-FITC和PI雙染出現(xiàn)了預(yù)期的僅Annexin V-FITC染色陽性的凋亡細(xì)胞和雙陽性的壞死細(xì)胞。出現(xiàn)的非預(yù)期的細(xì)胞點完全在許可的誤差范圍內(nèi)。實測數(shù)據(jù)可能會因細(xì)胞類型、細(xì)胞凋亡情況、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

本試劑盒小包裝C1062S可以檢測20個樣品，中包裝C1062M可以檢測50個樣品，大包裝C1062L可以檢測100個樣品。
包裝清單：

保存條件：
4℃保存，半年有效。-20℃保存，一年有效。Annexin V-FITC和碘化丙啶染色液需要避光保存。為了長期保存，可以把碘化丙啶染色液適當(dāng)分裝后-20℃保存。
注意事項：
盡管經(jīng)測試Annexin V-FITC反復(fù)凍融5次對于其檢測效果無顯著影響，但為取得良好的使用效果，3-6個月內(nèi)推薦4℃保存，并適當(dāng)注意避免反復(fù)凍融。
如果有細(xì)菌或真菌污染，會嚴(yán)重影響檢測效果。
染色后宜盡快檢測，時間過長可能會導(dǎo)致凋亡或壞死細(xì)胞的數(shù)量增加。
如果細(xì)胞收集過程中使用了胰酶，需注意設(shè)法去除殘留的胰酶。殘留的胰酶會消化并降解Annexin V-FITC，導(dǎo)致染色失敗。
熒光物質(zhì)均易發(fā)生淬滅，在進(jìn)行熒光觀察時，盡量縮短觀察時間，同時在操作和存放過程中也盡量注意避光保存。
用于流式細(xì)胞儀檢測時，如果發(fā)現(xiàn)Annexin V-FITC單獨染色時出現(xiàn)了過多的PI假陽性細(xì)胞，并且通過調(diào)整相關(guān)設(shè)置和參數(shù)也無法改善，可以用PBS將Annexin V-FITC稀釋3-10倍后再進(jìn)行檢測，這樣通常可以有效減少假陽性的壞死細(xì)胞。
需自備PBS。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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使用說明：
1. 對于懸浮細(xì)胞：
a. 在進(jìn)行完細(xì)胞凋亡刺激后，1000g離心5分鐘，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計數(shù)。注意：PBS重懸不能省略，PBS重懸的過程同時也起到了洗滌細(xì)胞的作用，可以保證后續(xù)Annexin V-FITC的結(jié)合。
b. 取5-10萬重懸的細(xì)胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入195μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。
c. 加入5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。
d. 加入10μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻。
e. 室溫(20-25℃)避光孵育10-20分鐘，隨后置于冰浴中。可以使用鋁箔進(jìn)行避光。孵育過程中可以重懸細(xì)胞2-3次以改善染色效果。
f. 如果用于流式細(xì)胞儀檢測，可立即上機(jī)檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，碘化丙啶(PI)為紅色熒光，流式檢測細(xì)胞凋亡的效
果及其驗證請參考圖1和圖2。初次進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測時，建議選擇一組適當(dāng)?shù)募?xì)胞參考圖2設(shè)置未染色、PI單染和Annexin V-FITC單染這3個對照。如果用于熒光顯微鏡檢測，1000g離心5分鐘，收集細(xì)胞，用50-100μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。注意：細(xì)胞在染色后須盡快完成檢測，通常宜在1小時之內(nèi)完成檢測。用于流式細(xì)胞儀檢測時，如果發(fā)現(xiàn)Annexin V-FITC單獨染色時出現(xiàn)了過多的PI假陽性細(xì)胞，并且通過調(diào)整相關(guān)設(shè)置和參數(shù)也無法改善，可以用PBS將Annexin V-FITC稀釋3-10倍后再進(jìn)行檢測。
2. 對于貼壁細(xì)胞的消化后檢測：
a. 把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細(xì)胞一次，加入適量胰酶細(xì)胞消化液(可含有EDTA)消化細(xì)胞。室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來時，吸除胰酶細(xì)胞消化液。需避免胰酶的過度消化。注意：對于貼壁細(xì)胞，胰酶消化步驟很關(guān)鍵。胰酶消化時間如果過短，細(xì)胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細(xì)胞膜的損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞壞死的假陽性；消化時間如果過長，同樣易造成細(xì)胞膜損傷而出現(xiàn)細(xì)胞壞死的假陽性，甚至?xí)�影響�?xì)胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-FITC的結(jié)合從而干擾對于細(xì)胞凋亡的檢測。同時，胰酶細(xì)胞消化液中應(yīng)盡量不含EDTA，因為EDTA可能會影響Annexin V與磷脂酰絲氨酸的結(jié)合。
b. 加入步驟2a中收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，把細(xì)胞輕輕吹打下來，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000g離心5分鐘，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計數(shù)。注意：加入步驟2a中的細(xì)胞培養(yǎng)液非常重要，一方面可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細(xì)胞，另一方面細(xì)胞培養(yǎng)液中的血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶。殘留的胰酶會消化并降解后續(xù)加入的Annexin V-FITC，導(dǎo)致染色失敗。
c. 取5-10萬重懸的細(xì)胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入195μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。
d. 加入5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。
e. 加入10μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻。
f. 室溫(20-25℃)避光孵育10-20分鐘，隨后置于冰浴中。可以使用鋁箔進(jìn)行避光。孵育過程中可以重懸細(xì)胞2-3次以改善染色效果。
g. 如果用于流式細(xì)胞儀檢測，可立即上機(jī)檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，碘化丙啶(PI)為紅色熒光，流式檢測的效果及其驗
證請參考圖1和圖2。如果用于熒光顯微鏡檢測，1000g離心5分鐘，收集細(xì)胞，用50-100μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。注意：細(xì)胞在染色后須盡快完成檢測，通常宜在1小時之內(nèi)完成檢測。用于流式細(xì)胞儀檢測時，如果發(fā)現(xiàn)Annexin V-FITC單獨染色時出現(xiàn)了過多的PI假陽性細(xì)胞，并且通過調(diào)整相關(guān)設(shè)置和參數(shù)也無法改善，可以用PBS
將Annexin V-FITC稀釋3-10倍后再進(jìn)行檢測。
3. 對于貼壁細(xì)胞的原位熒光檢測：
注：本方法的優(yōu)點是可以原位觀察細(xì)胞凋亡，缺點是部分凋亡由于不貼壁而檢測不到。
a. (選做)如果條件許可，把細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板、48孔板或96孔板內(nèi)。在凋亡誘導(dǎo)結(jié)束后，用可以對多孔板進(jìn)行離心的離心機(jī)1000g離心5分鐘。
b. 吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入PBS洗滌一次。如果條件許可，在吸除PBS前1000g離心5分鐘。
c. 加入195μl Annexin V-FITC結(jié)合液。
d. 加入5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。
e. 加入10μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻。
f. 室溫(20-25℃)避光孵育10-20分鐘，隨后置于冰浴中�？梢允褂娩X箔進(jìn)行避光。
g. 隨即在熒光顯微鏡下觀察，Annexin V-FITC為綠色熒光，碘化丙啶(PI)為紅色熒光。注意：細(xì)胞在染色后須盡快完成檢測，通常宜在1小時之內(nèi)完成檢測。

圖3. Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)染色效果圖。圖中綠色熒光為Annexin V-FITC染色陽性細(xì)胞，紅色熒光為碘化丙啶染色陽性細(xì)胞。僅被綠色熒光染色的為凋亡細(xì)胞，被綠色和紅色熒光雙染的是壞死細(xì)胞，未被熒光染色的為正常細(xì)胞。Vehicle組為陰性對照，Annexin V-FITC染色和碘化丙啶染色都非常弱，L-929細(xì)胞處于正常狀態(tài)；TSZ組為陽性對照，L-929細(xì)胞用TSZ處理3小時。TSZ為TNFα、SM-164和Z-VAD-FMK組成的細(xì)胞壞死誘導(dǎo)試劑(C1058)。

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