線粒體膜電位與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Mitochondrial Membrane Potential and Apoptosis Detection Kit with Mito-Tracker Red CMXRos and Annexin V-FITC)是一種聯(lián)合使用線粒體膜電位依賴性的紅色熒光探針Mito-Tracker Red CMXRos(也稱MitoTracker Red CMXRos)和細(xì)胞凋亡綠色熒光探針Annexin V-FITC來檢測培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體膜電位和細(xì)胞凋亡的紅綠熒光雙染試劑盒。紅色熒光標(biāo)記的是保持線粒體膜電位的活細(xì)胞，而綠色熒光標(biāo)記的是發(fā)生了凋亡或壞死的細(xì)胞。同時(shí)試劑盒還提供了用于細(xì)胞核熒光染色的Hoechst 33342染色液，便于在有需要的時(shí)候同時(shí)通過細(xì)胞核的碎裂和致密濃染等從形態(tài)學(xué)上觀察細(xì)胞凋亡。

本試劑盒使用便捷，結(jié)果清晰。本產(chǎn)品同時(shí)檢測線粒體膜電位變化和磷酯酰絲氨酸外翻兩個(gè)重要的凋亡檢測指標(biāo)。本試劑盒檢測后，活細(xì)胞綠色熒光陰性，但紅色熒光陽性；而凋亡細(xì)胞綠色熒光陽性，同時(shí)紅色熒光顯著減弱或者呈現(xiàn)陰性，活細(xì)胞和死細(xì)胞的紅綠熒光對比非常鮮明(參見圖1)，可以使用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀或其它熒光檢測設(shè)備進(jìn)行檢測。需要指出的是，紅色熒光染色在誘導(dǎo)凋亡或壞死后會(huì)逐漸減弱，但部分紅色熒光減弱的細(xì)胞不一定綠色熒光染色陽性。需要指出的是，磷酯酰絲氨酸外翻是細(xì)胞凋亡的早期事件，在凋亡早期不一定會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞核碎裂或致密濃染等細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化。

圖1. 本試劑盒檢測正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞的效果。Vehicle組為正常培養(yǎng)的L-929細(xì)胞，細(xì)胞能被線粒體紅色熒光探針Mito-Tracker Red CMXRos染色，但Annexin V-FITC綠色熒光染色陰性；L-929細(xì)胞經(jīng)過TNFα+SM-164處理4小時(shí)后，一些凋亡的細(xì)胞綠色熒光呈現(xiàn)陽性，同時(shí)紅色熒光顯著減弱或者呈現(xiàn)陰性。圖中的藍(lán)色熒光為Hoechst 33342染色。TNFα+SM-164是一種細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)試劑盒(C0006S)。
細(xì)胞凋亡(Apoptosis)是生物體發(fā)育等生命過程中普遍存在的、由基因決定的細(xì)胞主動(dòng)有序的死亡方式。當(dāng)細(xì)胞遇到內(nèi)、外環(huán)境因子刺激時(shí)，啟動(dòng)基因調(diào)控的自殺保護(hù)措施，去除體內(nèi)非必需細(xì)胞或即將發(fā)生特化的細(xì)胞。在這一過程中，細(xì)胞脫落離體或裂解為若干凋亡小體，并迅速被巨噬細(xì)胞或鄰近細(xì)胞清除，這是一種由基因控制、高度有序的細(xì)胞自主死亡，包含一系列信號(hào)事件組成的通路。細(xì)胞凋亡失調(diào)與多種疾病有關(guān)，例如阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease)和癌癥等。
細(xì)胞凋亡通過特征性的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)變化而區(qū)別于壞死(Necrosis)，包括細(xì)胞皺縮、細(xì)胞核皺縮、核膜核仁破碎等等。在正常活細(xì)胞中，磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，簡稱PS)位于細(xì)胞膜的近細(xì)胞質(zhì)面。而在凋亡細(xì)胞中，PS從質(zhì)膜的內(nèi)部外翻到細(xì)胞表面即細(xì)胞膜外側(cè)，從而使PS暴露于細(xì)胞外部。在白細(xì)胞的凋亡過程中，白細(xì)胞表面的PS標(biāo)記可以被巨噬細(xì)胞識(shí)別，從而最終被巨噬細(xì)胞吞噬。人血管抗凝血?jiǎng)〢nnexin V是一種35-36kDa Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，對PS具有高親和力。用帶有綠色熒光的FITC標(biāo)記的Annexin V (Annexin V-FITC)染色細(xì)胞，就可以通過熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡或流式細(xì)胞儀等熒光檢測設(shè)備非常簡單而直接地檢測到磷酯酰絲氨酸的外翻這一細(xì)胞凋亡的重要特征。需要指出的是對于壞死細(xì)胞，由于細(xì)胞膜的完整性被破壞，位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的PS也會(huì)被Annexin V-FITC染色。
Mito-Tracker Red CMXRos (線粒體紅色熒光探針)是一種具有細(xì)胞通透性的X-rosamine衍生物(Chloromethyl-X-rosamine，簡稱CMXRos)，能夠特異性地標(biāo)記細(xì)胞中具有生物活性的線粒體。對于正常細(xì)胞，Mito-Tracker Red CMXRos可以把其中的線粒體染色為明亮的紅色熒光，而當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡等時(shí)，線粒體膜電位下降，此時(shí)線粒體的紅色熒光會(huì)逐漸減弱，甚至呈現(xiàn)紅色熒光陰性。
本試劑盒檢測的是Mito-Tracker Red CMXRos的紅色熒光和Annexin V-FITC的綠色熒光。同時(shí)本試劑盒提供Hoechst 33342，Hoechst 33342是一種具有細(xì)胞膜通透性的藍(lán)色熒光染料，對細(xì)胞的毒性較低，是一種優(yōu)秀的活細(xì)胞細(xì)胞核染料。Hoechst 33342、Annexin V-FITC和Mito-Tracker Red CMXRos的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考圖2。

圖2. Hoechst 33342、Annexin V-FITC和Mito-Tracker Red CMXRos的激發(fā)光譜與發(fā)射光譜。

本試劑盒小包裝C1071S可以檢測20個(gè)樣品，中包裝C1071M可以檢測50個(gè)樣品。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存，一年有效。Mito-Tracker Red CMXRos染色液、Annexin V-FITC和Hoechst 33342染色液需避光保存。
注意事項(xiàng)：
盡管經(jīng)測試Annexin V-FITC反復(fù)凍融5次對于其檢測效果無顯著影響，但為取得良好的使用效果，3-6個(gè)月內(nèi)推薦4℃保存，并適當(dāng)注意避免反復(fù)凍融。
如果細(xì)胞有細(xì)菌或真菌污染，會(huì)嚴(yán)重影響檢測效果。
染色后宜盡快檢測，時(shí)間過長可能會(huì)導(dǎo)致凋亡或壞死細(xì)胞的數(shù)量增加。
如果細(xì)胞收集過程中使用了胰酶，需注意設(shè)法去除殘留的胰酶。殘留的胰酶可能會(huì)降解Annexin V-FITC，導(dǎo)致染色失敗。
熒光物質(zhì)均易發(fā)生淬滅，在進(jìn)行熒光觀察時(shí)，盡量縮短觀察時(shí)間，同時(shí)在操作和存放過程中也盡量注意避光保存。
用于流式細(xì)胞儀檢測時(shí)，如果發(fā)現(xiàn)Annexin V-FITC信號(hào)過強(qiáng)，并且通過調(diào)整相關(guān)設(shè)置和參數(shù)也無法改善，可以用PBS將Annexin V-FITC稀釋3-10倍后再進(jìn)行檢測。
需自備PBS或HBSS。
Mito-Tracker Red CMXRos染色液和Hoechst 33342染色液對人體有害，操作時(shí)請小心，并注意有效防護(hù)以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1. 對于懸浮細(xì)胞：
a. 在進(jìn)行完細(xì)胞凋亡刺激后，1000g離心5分鐘，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。注意：PBS重懸不能省略，PBS重懸的過程同時(shí)也起到了洗滌細(xì)胞的作用，可以保證后續(xù)Annexin V-FITC的結(jié)合。
b. 取5-10萬重懸的細(xì)胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入188μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。
c. 加入2μl Mito-Tracker Red CMXRos染色液、5μl Annexin V-FITC和5μl Hoechst 33342染色液，輕輕混勻。注意：Hoechst 33342染色液可以選擇性加入，不加入也是可以的。
d. 室溫(20-25℃)避光孵育20-30分鐘，隨后置于冰浴中�？梢允褂娩X箔進(jìn)行避光。孵育過程中可以重懸細(xì)胞2-3次以改善染色效果。
e. 如果用于流式細(xì)胞儀檢測，可立即上機(jī)檢測，Mito-Tracker Red CMXRos為紅色熒光(Ex/Em:579/599nm)，Annexin V-FITC為綠色熒光(Ex/Em:492/520nm)，Hoechst 33342為藍(lán)色熒光(Ex/Em:350/461nm)，很多時(shí)候流式檢測僅檢測紅色和綠色熒光即可，也可以同時(shí)檢測紅綠藍(lán)三色熒光。如果用于熒光顯微鏡檢測，1000g離心5分鐘，收集細(xì)胞，用50-100μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。
注意：細(xì)胞在染色后須盡快完成檢測，通常宜在1小時(shí)之內(nèi)完成檢測；熒光探針的濃度可以根據(jù)具體的染色效果進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，以獲得更好的染色效果；熒光顯微鏡檢測或流式細(xì)胞儀檢測時(shí)，都可以不加入Hoechst 33342染色液。
2. 對于貼壁細(xì)胞的消化后檢測：
a. 把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細(xì)胞一次，加入適量胰酶細(xì)胞消化液(可含有EDTA)消化細(xì)胞。室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來時(shí)，吸除胰酶細(xì)胞消化液。需避免胰酶的過度消化。
注意：對于貼壁細(xì)胞，胰酶消化步驟很關(guān)鍵。胰酶消化時(shí)間如果過短，細(xì)胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細(xì)胞膜的損傷；消化時(shí)間如果過長，同樣易造成細(xì)胞膜損傷，甚至?xí)�影響�?xì)胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-FITC的結(jié)合從而干擾對于細(xì)胞凋亡的檢測。同時(shí)，胰酶細(xì)胞消化液中應(yīng)盡量不含EDTA，因?yàn)镋DTA可能會(huì)影響Annexin V與磷脂酰絲氨酸的結(jié)合。
b. 加入步驟2a中收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000g離心5分鐘，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。注意：加入步驟2a中的細(xì)胞培養(yǎng)液一方面可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細(xì)胞，另一方面細(xì)胞培養(yǎng)液中的血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶；殘留的胰酶會(huì)消化并降解后續(xù)加入的Annexin V-FITC導(dǎo)致染色失敗。
c. 取5-10萬重懸的細(xì)胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入188μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。
d. 加入2μl Mito-Tracker Red CMXRos染色液、5μl Annexin V-FITC和5μl Hoechst 33342染色液，輕輕混勻。注意：Hoechst 33342染色液可以選擇性加入，不加入也是可以的。
e. 室溫(20-25℃)避光孵育20-30分鐘，隨后置于冰浴中。可以使用鋁箔進(jìn)行避光。孵育過程中可以重懸細(xì)胞2-3次以改善染色效果。
f. 如果用于流式細(xì)胞儀檢測，可立即上機(jī)檢測，Mito-Tracker Red CMXRos為紅色熒光(Ex/Em:579/599nm)，Annexin V-FITC為綠色熒光(Ex/Em:492/520nm)，Hoechst 33342為藍(lán)色熒光(Ex/Em:350/461nm)，很多時(shí)候流式檢測僅檢測紅色和綠色熒光即可，也可以同時(shí)檢測紅綠藍(lán)三色熒光。如果用于熒光顯微鏡檢測，1000g離心5分鐘，收集細(xì)胞，用50-100μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。
注意：細(xì)胞在染色后須盡快完成檢測，通常宜在1小時(shí)之內(nèi)完成檢測；熒光探針的濃度可以根據(jù)具體的染色效果進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，以獲得更好的染色效果；熒光顯微鏡檢測或流式細(xì)胞儀檢測時(shí)，都可以不加入Hoechst 33342染色液。
3. 對于貼壁細(xì)胞的原位熒光檢測：
注：本方法的優(yōu)點(diǎn)是可以原位觀察細(xì)胞凋亡，缺點(diǎn)是部分凋亡由于不貼壁而檢測不到。
a. (選做)如果條件許可，把細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板、48孔板或96孔板內(nèi)。在凋亡誘導(dǎo)結(jié)束后，用可以對多孔板進(jìn)行離心的離心機(jī)1000g離心5分鐘。
b. 吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入PBS洗滌一次。如果條件許可，在吸除PBS前1000g離心5分鐘。
c. 加入188µl Annexin V-FITC結(jié)合液。
d. 加入5µl Annexin V-FITC，輕輕混勻。
e. 加入2μl Mito-Tracker Red CMXRos染色液和5μl Hoechst 33342染色液，輕輕混勻。注意：Hoechst 33342染色液可以選擇性加入，不加入也是可以的。
f. 室溫(20-25℃)避光孵育20-30分鐘，隨后置于冰浴中。可以使用鋁箔進(jìn)行避光。
g. 隨即在熒光顯微鏡下觀察，Mito-Tracker Red CMXRos為紅色熒光，Annexin V-FITC為綠色熒光，Hoechst 33342為藍(lán)色熒光。
注意：細(xì)胞在染色后須盡快完成檢測，通常宜在1小時(shí)之內(nèi)完成檢測。熒光顯微鏡檢測時(shí)，也可以不加入Hoechst 33342染色液。​