Cell Counting Kit-8,簡(jiǎn)稱CCK-8試劑盒或CCK8試劑盒,是一種基于WST-8而廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞 毒性的快速、高靈敏度檢測(cè)的試劑盒。
WST-8是一種類似于MTT的化合物,在電子耦合試劑存在的情況下,可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的
formazan(參考圖1)。細(xì)胞增殖越多越快,則顏色越深;細(xì)胞毒性越大,則顏色越淺。對(duì)于同樣的細(xì)胞,顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān) 系。
圖1. WST-8檢測(cè)原理圖 (EC=electron coupling reagent,即電子耦合試劑)
WST-8是MTT的一種升級(jí)替代產(chǎn)品,和MTT或其它MTT類似產(chǎn)品如XTT、MTS等相比有明顯的優(yōu)點(diǎn)。首先,MTT 被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成的formazan不是水溶性的,需要有特定的溶解液來溶解;而WST-8和XTT、MTS產(chǎn)生的formazan都是水溶性的,可 以省去后續(xù)的溶解步驟。其次,WST-8產(chǎn)生的formazan比XTT和MTS產(chǎn)生的formazan更易溶解。再次,WST-8比XTT和MTS更加穩(wěn)定,使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加穩(wěn) 定。另外,WST-8和MTT、XTT等相比線性范圍更寬,靈敏度更高。
WST-8和WST-1相比,檢測(cè)靈敏度更高,更易溶解,并且更加穩(wěn)定。
本試劑盒可以用于細(xì)胞因子等誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖檢測(cè),也可以用于抗癌藥物等對(duì)細(xì)胞有毒試劑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒 性檢測(cè),或一些藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制檢測(cè)。
本試劑盒檢測(cè)非常便捷。試劑盒僅一管已經(jīng)配制好的含有WST-8的CCK-8溶液,無須再進(jìn)行任何配制等操作 。無須使用同位素,所有的檢測(cè)步驟僅在同一塊96孔板內(nèi)完成。不必洗滌細(xì)胞,不必收集細(xì)胞,也不必采用額外的步驟去溶解formazan?梢杂糜 大批量樣品的檢測(cè)。
酚紅和血清對(duì)本試劑盒的測(cè)定無明顯影響。
WST-8對(duì)細(xì)胞無明顯毒性。加入CCK-8溶液顯色后,可以在不同時(shí)間反復(fù)用酶標(biāo)儀讀板,使檢測(cè)時(shí)間更加靈 活,便于找到最佳測(cè)定時(shí)間。
細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒的比較和選擇
本試劑盒可以測(cè)定100個(gè)樣品。
包裝清單:
產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
C0037 | CCK-8溶液 | 1ml |
— | 說明書 | 1份 |
保存條件:
4℃避光保存一年有效,-20℃避光保存兩年有效。
注意事項(xiàng):
由于使用96孔板進(jìn)行檢測(cè),如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng),一定要注意蒸發(fā)問題。一方面,由于96孔板周圍一圈 最容易蒸發(fā),可以采取棄用周圍一圈的辦法,改加相同量的PBS、水或培養(yǎng)液;另一方面,可以把96孔板置于靠近培養(yǎng)箱內(nèi)水源的地方,以緩解蒸 發(fā)。
本試劑盒的檢測(cè)依賴于脫氫酶催化的反應(yīng),所以還原劑(例如一些抗氧化劑)會(huì)干擾檢測(cè),如果待檢測(cè)體系 中存在較多的還原劑,需設(shè)法去除。
用酶標(biāo)儀檢測(cè)前需確保每個(gè)孔內(nèi)沒有氣泡,否則會(huì)干擾測(cè)定。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品,不得存放于普通 住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康,請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說明:
1. 通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞,細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000個(gè)細(xì)胞(具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目,需根據(jù)細(xì)胞的大小、細(xì)胞增殖速度的快慢等因素決定)。按照實(shí)驗(yàn)需要,進(jìn)行培養(yǎng)并給予0-10微升特定的藥物刺激。
2. 每孔加入10微升CCK-8溶液。如果起始的培養(yǎng)體積為200微升,則需加入20微升CCK-8溶液,其它情況以此類推?梢杂眉恿讼鄳(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒有加入細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照。如果擔(dān)心所使用的藥物會(huì)干擾檢測(cè),需設(shè)置加了相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液、藥物和CCK-8溶液但沒有加入細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照。
3. 在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育0.5-4小時(shí),對(duì)于大多數(shù)情況孵育1小時(shí)就可以了。時(shí)間的長(zhǎng)短根據(jù)細(xì)胞的類型和細(xì)胞的密度等實(shí)驗(yàn)情況而定,初次實(shí)驗(yàn)時(shí)可以在0.5、1、2和4小時(shí)后分別用酶標(biāo)儀檢測(cè),然后選取吸光度范圍比較適宜的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
4. 在450nm測(cè)定吸光度。如無450nm濾光片,可以使用420-480nm的濾光片。可以使用大于600nm的波長(zhǎng),例如650nm,作為參考波長(zhǎng)進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定。
5. 將不同數(shù)量的HeLa細(xì)胞按照每孔100微升培養(yǎng)液接種到96孔板中,培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁充分后,每孔加入10微升的CCK-8溶液孵育2小時(shí)后測(cè)定A450的檢測(cè)效果圖參考圖2。檢測(cè)效果僅供參考,實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)會(huì)因檢測(cè)儀器等的不同而存在差異。
圖2. CCK-8試劑盒測(cè)定不同數(shù)量HeLa細(xì)胞的檢測(cè)效果圖。實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)會(huì)因檢測(cè)儀器等的不同而存在差異,圖中數(shù)據(jù)僅供參考。
常見問題:
1. CCK-8溶液對(duì)細(xì)胞的毒性大小如何?
CCK-8溶液對(duì)細(xì)胞的毒性非常低,通常觀察不到細(xì)胞毒性。細(xì)胞在CCK-8法檢測(cè)后仍然可以正常生長(zhǎng),并可以用于其它的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。但為了避免CCK-8溶液可能帶來的對(duì)于后續(xù)檢測(cè)的影響,除非該細(xì)胞極難獲得,否則不推薦把CCK-8溶液孵育過的細(xì)胞用于其它實(shí)驗(yàn)。
2.如果吸光度值太低,可以采取什么辦法?
a.適當(dāng)增加細(xì)胞數(shù)量。
b.延長(zhǎng)加入CCK-8溶液后的孵育時(shí)間。