Enhanced Cell Counting Kit-8，簡稱增強型CCK-8試劑盒，是一種基于WST-8而廣泛應(yīng)用于細胞增殖和細胞毒性的快速、高靈敏度檢測的試劑盒，比普通的CCK-8試劑盒具有更好的檢測靈敏度和更寬的線性范圍。

WST-8是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的
formazan(參考圖1)。細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。對于同樣的細胞，顏色的深淺和細胞數(shù)目呈線性關(guān)系。

圖1. WST-8檢測原理圖 (EC=electron coupling reagent，即電子耦合試劑)

WST-8是MTT的一種升級替代產(chǎn)品，和MTT或其它MTT類似產(chǎn)品如XTT、MTS等相比有明顯的優(yōu)點。首先，MTT被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶解液來溶解；而WST-8和XTT、MTS產(chǎn)生的formazan都是水溶性的，可以省去后續(xù)的溶解步驟。其次，WST-8產(chǎn)生的formazan比XTT和MTS產(chǎn)生的formazan更易溶解。再次，WST-8比XTT和MTS更加穩(wěn)定，使實驗結(jié)果更加穩(wěn)定。另外，WST-8和MTT、XTT等相比線性范圍更寬，靈敏度更高。
WST-8和WST-1相比，檢測靈敏度更高，更易溶解，并且更加穩(wěn)定。
本試劑盒可以用于細胞因子等誘導(dǎo)的細胞增殖檢測，也可以用于抗癌藥物等對細胞有毒試劑誘導(dǎo)的細胞毒性檢測，或一些藥物誘導(dǎo)的細胞生長抑制檢測。
本試劑盒檢測非常便捷。試劑盒僅一管已經(jīng)配制好的含有WST-8的增強型CCK-8溶液，無須再進行任何配制等操作。無須使用同位素，所有的檢測步驟僅在同一塊96孔板內(nèi)完成。不必洗滌細胞，不必收集細胞，也不必采用額外的步驟去溶解formazan。可以用于大批量樣品的檢測。
酚紅和血清對本試劑盒的測定無明顯影響。
WST-8對細胞無明顯毒性。加入增強型CCK-8溶液顯色后，可以在不同時間反復(fù)用酶標儀讀板，使檢測時間更加靈活，便于找到最佳測定時間。
各種細胞增殖和細胞毒性檢測試劑盒的比較和選擇
本試劑盒可以測定100個樣品。
包裝清單：

保存條件：
4℃避光保存一年有效，-20℃避光保存兩年有效。
注意事項：
由于使用96孔板進行檢測，如果細胞培養(yǎng)時間較長，一定要注意蒸發(fā)問題。一方面，由于96孔板周圍一圈最容易蒸發(fā)，可以采取棄用周圍一圈的辦法，改加相同量的PBS、水或培養(yǎng)液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培養(yǎng)箱內(nèi)水源的地方，以緩解蒸發(fā)。
本試劑盒的檢測依賴于脫氫酶催化的反應(yīng)，所以還原劑(例如一些抗氧化劑)會干擾檢測，如果待檢測體系中存在較多的還原劑，需設(shè)法去除。
用酶標儀檢測前需確保每個孔內(nèi)沒有氣泡，否則會干擾測定。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作

使用說明：
1. 通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000個細胞(具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小、細胞增殖速度的快慢等因素決定)。按照實驗需要，進行培養(yǎng)并給予0-10微升特定的藥物刺激。
2. 每孔加入10微升增強型CCK-8溶液。如果起始的培養(yǎng)體積為200微升，則需加入20微升增強型CCK-8溶液，其它情況以此類推�？梢杂眉恿讼鄳�(yīng)量細胞培養(yǎng)液和增強型CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作為空白對照。如果擔(dān)心所使用的藥物會干擾檢測，需設(shè)置加了相應(yīng)量細胞培養(yǎng)液、藥物和增強型CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作為空白對照。
3. 在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育0.5-4小時，對于大多數(shù)情況孵育1小時就可以了。時間的長短根據(jù)細胞的類型和細胞的密度等實驗情況而定，初次實驗時可以在0.5、1、2和4小時后分別用酶標儀檢測，然后選取吸光度范圍比較適宜的一個時間點用于后續(xù)實驗。
4. 在450nm測定吸光度。如無450nm濾光片，可以使用420-480nm的濾光片。可以使用大于600nm的波長，例如650nm，作為參考波長進行雙波長測定。
5. 將不同數(shù)量的HeLa細胞按照每孔100微升培養(yǎng)液接種到96孔板中，培養(yǎng)至細胞貼壁充分后，每孔加入10微升的增強型CCK-8溶液孵育2小時后測定A450的檢測效果圖參考圖2。檢測效果僅供參考，實測數(shù)據(jù)會因檢測儀器等的不同而存在差異。

圖2. 增強型CCK-8試劑盒測定不同數(shù)量HeLa細胞的檢測效果圖。實測數(shù)據(jù)會因檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

常見問題：
1. 增強型CCK-8溶液對細胞的毒性大小如何？
增強型CCK-8溶液對細胞的毒性非常低，和普通的CCK-8溶液相當(dāng)或者毒性更低，通常觀察不到細胞毒性。細胞在CCK-8法檢測后仍然可以正常生長，并以用于其它的細胞實驗。但為了避免增強型CCK-8溶液可能帶來的對于后續(xù)檢測的影響，除非該細胞極難獲得，否則不推薦把增強型CCK-8溶液孵育過的細胞用于其它實驗。
2. 如果吸光度值太低，可以采取什么辦法？
a. 適當(dāng)增加細胞數(shù)量。
b. 延長加入增強型CCK-8溶液后的孵育時間。

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