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小RNA 3’接頭(5’腺苷化, 3’封閉)及連接試劑盒

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 研發(fā)生產(chǎn)的小RNA 3’接頭(5’腺苷化, 3’封閉)及連接試劑盒(Small RNA 3′-Linker (5'adenylated, 3'blocked) and Ligation Kit),是一種提供了5’腺苷化和3’封閉的Universal miRNA Cloning Linker及相應(yīng)的連接酶和配套試劑,用于miRNA等3’端為羥基的小RNA和接頭連接的試劑盒。3’端連接了接頭的小RNA后續(xù)可以用于其克隆、高通量測序建庫或PCR檢測等。

本試劑盒也可以用于3’端為羥基的單鏈DNA和接頭的連接,因此也可以稱為單鏈DNA 3’接頭(5’腺苷化, 3’封閉)及連接試劑盒(ssDNA 3'-Linker (5'adenylated, 3'blocked) and Ligation Kit),或核酸3’接頭(5’腺苷化, 3’封閉)及連接試劑盒(3’-Linker (5'adenylated, 3'blocked) and Ligation Kit)。

本試劑盒提供的Universal miRNA Cloning Linker,其5´端腺苷;(也稱5'端預腺苷;5'端預腺苷化,5'pre-adenylated或5'pre-adenylation),3'端氨基封閉,可以用于3’端為羥基的RNA的3’端接頭的添加。本試劑盒中提供的T4 RNA Ligase2, truncated可以識別“活化”的5´端腺苷;腢niversal miRNA Cloning Linker,在無需ATP存在的條件下,可將Universal miRNA Cloning Linker的5´端與另外一條單鏈寡核苷酸的3´端羥基共價連接。

使用本試劑盒和miRNA連接時,可以有效避免miRNA的自連、不同miRNA之間的連接、Linker的環(huán)化或Linker分子之間的連接,而僅發(fā)生Linker 5'端和miRNA 3'羥基之間的特異性連接。

本試劑盒催化連接Universal miRNA Cloning Linker和ssRNA的效果請參見圖1。

圖1. 生產(chǎn)的小RNA 3’接頭(5’腺苷化, 3’封閉)及連接試劑盒催化連接Universal miRNA Cloning Linker (AppDNA)和ssRNA的效果圖。反應(yīng)體系為20μl,Universal miRNA Cloning Linker (AppDNA)的終濃度為1μM,單鏈RNA的終濃度為0.5μM,反應(yīng)條件為25℃孵育60min,反應(yīng)完畢后立即取樣在65℃孵育20min終止反應(yīng),加入變性上樣緩沖液并在95℃孵育5min后放至冰浴中,隨后用15%尿素(7M)變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳,最終進行核酸染色和熒光成像分析。如圖所示,本試劑盒催化連接Universal miRNA Cloning Linker和ssRNA的效率非常高。

本試劑盒提供的Universal miRNA Cloning Linker的序列是:5´-rAppCTGTAGGCACCATCAAT–NH2-3´。該序列同NEB公司的S1315S Universal miRNA Cloning Linker。

本試劑盒如果用于20µl的反應(yīng)體系,并按照本試劑盒推薦的連接體系,可以用于20次的Universal miRNA Cloning Linker和ssRNA的連接反應(yīng)。

包裝清單:

產(chǎn)品編號 產(chǎn)品名稱 包裝
R0700S-1 Universal miRNA Cloning Linker (6.9µM) 29µl
R0700S-2 DEPC-treated Water 100µl
R0700S-3 PEG8000 (50%, RNase Free) 300µl
R0700S-4 RNase Inhibitor (40U/μl) 20µl
R0700S-5 T4 RNA Ligase2, truncated (200U/µl) 20µl
R0700S-6 10X T4Rnl2, truncated Buffer 50µl
說明書 1份

保存條件:

-20℃保存,至少一年有效。

注意事項:

本試劑盒附帶提供的試劑均用DEPC水配制,可直接用于底物為單鏈RNA (3’端需為羥基)和Universal miRNA Cloning Linker (5′ adenylated, 3′ blocked) 的連接反應(yīng)。

使用本試劑盒連接ssRNA和Universal miRNA Cloning Linker (5′ adenylated, 3′ blocked)時,建議使用的PEG8000的濃度為10% -30%,適當提高PEG8000的濃度,會顯著提高連接效率。

可根據(jù)具體應(yīng)用選擇合適的操作方法,可能需準備額外的試劑,如RNase inhibitor、DEPC水等。

根據(jù)連接反應(yīng)的類型,推薦在反應(yīng)體系中加入適量的PEG8000。建議RNA環(huán)化反應(yīng)體系中PEG8000的終濃度為10%,連接單鏈RNA或DNA的分之間連接反應(yīng)體系中PEG8000的終濃度為15%-25%,這樣可以顯著提高酶活性,同時不影響反應(yīng)特性。

本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品,不得存放于普通住宅內(nèi)。

為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明:
1.用于連接Universal miRNA Cloning Linker和單鏈RNA (ssRNA)的3’羥基末端時,參考下表在冰浴中配制如下反應(yīng)體系:

Reagent Volume Final Concentration
ssRNA xµl 0.5µM
DEPC-treated Water 2.55-xµl -
Universal miRNA Cloning Linker (6.9µM) 1.45µl 0.5µM
PEG8000 (50%, RNase Free) 12µl 0.3
10X T4 Rnl2, truncated Buffer 2µl 1 X
RNase Inhibitor (40U/μl) 1µl 2U/μl
T4 RNA Ligase2, truncated 1µl -
Total Volume 20µl -

注意:
a.由于涉及RNA操作,需要嚴格按照RNA操作的規(guī)范進行,避免RNase污染,相關(guān)試劑和耗材需要經(jīng)過DEPC處理去除RNase或者確保是RNase free的。推薦在連接體系中添加RNase inhibitor,以避免ssRNA或其連接產(chǎn)物的降解,盡管經(jīng)測試我們發(fā)現(xiàn)在嚴格操作的情況下,不加RNase inhibitor也不會導致ssRNA或其連接產(chǎn)物發(fā)生明顯降解。
b.進行連接反應(yīng)時,通常推薦ssRNA和linker按照1:1進行連接反應(yīng),以適當節(jié)約本試劑盒。如果樣品RNA比較珍貴,希望充分被連接,可以按照接頭和樣品RNA的摩爾比為2:1的比例進行連接;如果樣品RNA比較充裕,同時感覺本試劑盒的成本偏高時,可以按照接頭和樣品RNA的摩爾比摩爾比1:1甚至1:2的比例進行連接反應(yīng),這樣可以很好地節(jié)省本試劑盒。
c.如果同時進行多個連接反應(yīng),可以把上表中除ssRNA之外的所有溶液和酶提前預混合,然后再分裝到各反應(yīng)管內(nèi)。
2.連接反應(yīng):25℃, 孵育60min。為了使連接反應(yīng)更加充分,可以適當延長連接反應(yīng)時間。
3.終止反應(yīng):65℃,孵育20min。

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