Antarctic Phosphatase (Thermosensitive)，是一種源自南極微生物的、熱敏感的重組表達(dá)純化的磷酸酶，可以催化去除DNA、RNA、dNTP、rNTP 5'或3’末端磷酸基團(tuán)。DNA或RNA 5’端脫去磷酸基團(tuán)(簡(jiǎn)稱脫磷或去磷)后就不能被連接酶(ligase)所連接，常用于避免載體的自連、提高基因克隆時(shí)的陽(yáng)性率、選擇性連接特定序列等。

Antarctic Phosphatase也可以脫去蛋白質(zhì)絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基上的磷酸基團(tuán)。

Antarctic Phosphatase是一種新型堿性磷酸酯酶，在各種內(nèi)切酶和PCR緩沖液中可保持不低于100%的活性，對(duì)于各種類型的DNA 5’末端的去磷酸化均可在37℃孵育15分鐘即可完成，并且75℃孵育5分鐘即可完全失活。

堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, AP/ALP/AKP/ALKP/ALPase/Alk Phos, EC 3.1.3.1)常被稱作堿性磷酸酯酶，是一類水解酶，通過(guò)水解磷酸單酯將底物分子上的磷酸基團(tuán)除去，并生成磷酸根離子和自由的羥基。其去磷酸化作用的底物包括核苷酸、蛋白質(zhì)和生物堿等，并在堿性條件下最為有效。該酶是一組同功酶的統(tǒng)稱。常見(jiàn)的小牛腸堿性磷酸酶(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase, CIAP/CIP)被廣泛用于二抗等的標(biāo)記，最終用于蛋白和核酸等的檢測(cè)，也常用于DNA或RNA 5'和3'末端的去磷酸化(去單磷酸化)，特別是質(zhì)粒的5'末端去磷酸化以避免質(zhì)粒自連等。

經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切的質(zhì)粒5'端帶有磷酸基團(tuán)，在進(jìn)行基因克隆時(shí)為避免質(zhì)粒自連，可以使用Antarctic Phosphatase去除5'末端磷酸基團(tuán)。脫去5'末端磷酸基團(tuán)的質(zhì)粒不能發(fā)生自連。

本產(chǎn)品主要特點(diǎn)：快速去磷酸化，只需37℃孵育15分鐘即可；快速失活，75℃孵育5分鐘即可完全失活；使用方便，在各種內(nèi)切酶和PCR緩沖液中保持不低于100%的活性，可以和質(zhì)粒DNA的酶切等同時(shí)進(jìn)行；兼容性強(qiáng)，對(duì)于5'或3'突出末端、平端等各種DNA的脫磷酸化采用完全相同的操作步驟；適用于后續(xù)的連接反應(yīng)，經(jīng)Antarctic Phosphatase脫磷酸基團(tuán)，并75℃孵育5分鐘失活后，通過(guò)柱純化或凝膠電泳后切膠回收純化等適當(dāng)處理后，可用于后續(xù)的連接反應(yīng)。

用途：通過(guò)去除載體或DNA片段5'末端的磷酸基團(tuán)，防止載體或DNA片段自連；質(zhì)粒DNA同時(shí)進(jìn)行內(nèi)切酶消化和脫磷；通過(guò)5'末端脫磷，制備用于T4PNK進(jìn)行5'末端標(biāo)記的DNA或RNA；去除DNA、RNA、rNTP和dNTP的5'末端的磷酸基團(tuán)；PCR產(chǎn)物中去除dNTP和焦磷酸根；用于蛋白質(zhì)絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸殘基的去磷酸化。

來(lái)源：大腸桿菌重組表達(dá)。Antarctic Phosphatase通常會(huì)形成同源二聚體，其單體的分子量為35kD。

酶活性定義： 1µg線性化的pUC19在37℃孵育30分鐘可以導(dǎo)致后續(xù)的自連反應(yīng)抑制率達(dá)到95%以上定義為一個(gè)活力單位。

純度：不含DNA外切酶和內(nèi)切酶，不含RNA酶。

酶儲(chǔ)存溶液：10mM Tris-HCl (pH7.4)，1mM MgCl2，0.1mM ZnCl2，50% (v/v) glycerol。

Antarctic Phosphatase Reaction Buffer (10X):500mM Bis-Tris-Propane HCl，10mM MgCl2，1mM ZnCl2，pH 6.0。

失活或抑制：75℃加熱5分鐘可使Antarctic Phosphatase充分失活。EDTA等金屬離子螯合劑對(duì)Antarctic Phosphatase有抑制作用。

Antarctic Phosphatase75℃滅活前后的酶活對(duì)比(參見(jiàn)圖1)。

圖1. 熱敏堿性磷酸酶Antarctic Phosphatase 75℃滅活前后的酶活對(duì)比。以pNPP為底物進(jìn)行比色法測(cè)定，滅活采用75℃加熱處理5分鐘。反應(yīng)體系為：50µl底物緩沖液(10mM pNPP等)，2µl稀釋125倍后的Antarctic Phosphatase (圓形和三角形圖標(biāo)分別代表是否經(jīng)過(guò)75℃加熱處理5分鐘的酶)�；靹蚝笫覝胤磻�(yīng)20分鐘，每隔1 min測(cè)定一次OD405。

生產(chǎn)的Antarctic Phosphatase對(duì)單酶切后的載體進(jìn)行脫磷處理可以大大降低載體單酶切后的自連率(參見(jiàn)圖2)。

圖2. Antarctic Phosphatase對(duì)BamHI單酶切后的pUC18載體進(jìn)行脫磷處理可以大大降低載體自連。A. pUC18質(zhì)粒經(jīng)BamHI單酶切過(guò)夜，不使用Antarctic Phosphatase進(jìn)行脫磷處理，然后載體用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化DH5α的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。B. pUC18質(zhì)粒經(jīng)BamHI單酶切，使用Antarctic Phosphatase在37℃脫磷處理15分鐘，75℃滅活處理5分鐘，然后載體用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化DH5α的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本產(chǎn)品處理后可以使大于95%的單酶切質(zhì)粒脫磷而避免自連。

Antarctic Phosphatase對(duì)雙酶切后的載體進(jìn)行脫磷處理可以大大提高克隆的陽(yáng)性率(參見(jiàn)圖3)。

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圖3. Antarctic Phosphatase對(duì)EcoRI/BamHI雙酶切后的pUC18載體進(jìn)行脫磷處理可以大大提高克隆的陽(yáng)性率。A、C. 經(jīng)EcoRI/BamHI雙酶切過(guò)夜的pUC18質(zhì)粒未做脫磷處理，加入EcoRI/BamHI雙酶切后600bp的PCR產(chǎn)物片段，然后用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化DH5α的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(A)及從該平板挑取10個(gè)單克隆、使用pUC18通用引物、進(jìn)行菌落PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(C)；B、D. 經(jīng)EcoRI/BamHI雙酶切的pUC18質(zhì)粒使用Antarctic Phosphatase在37℃脫磷處理15分鐘，75℃滅活處理5分鐘，柱純化后加入經(jīng)EcoRI/BamHI雙酶切的后600bpPCR產(chǎn)物片段，然后用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化DH5α的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(B)及從該從平板挑取10個(gè)單克隆、使用pUC18通用引物、進(jìn)行菌落PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(D)。

包裝清單：

保存條件：

-20℃保存。

注意事項(xiàng)：

Antarctic Phosphatase與其它堿性磷酸酶相同，其酶活性需要有Zn2+和Mg2+的存在。反應(yīng)中加入1/10體積的Antarctic Phosphatase Reaction Buffer (10X)，能夠提供足夠的Zn2+和Mg2+等以保證酶的活性。

Antarctic Phosphatase在NEB buffers 1、2、3、4和CutSmart緩沖液中時(shí)，必須同時(shí)加入Antarctic Phosphatase Reaction Buffer (10X)才有活性。

Antarctic Phosphatase在單價(jià)鹽離子存在時(shí)活性增強(qiáng)。

Antarctic Phosphatase在EDTA等金屬離子螯合劑、無(wú)機(jī)磷酸鹽及磷酸鹽類似物存在時(shí)，其活性被抑制。

Antarctic Phosphatase在DTT、巰基乙醇等還原劑存在時(shí)，其活性會(huì)降低。

本使用時(shí)宜存放在冰盒內(nèi)或冰浴上，使用完畢后該立即放置于-20℃保存。

本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說(shuō)明：
1. Antarctic Phosphatase在酶切反應(yīng)中對(duì)質(zhì)粒DNA 5'末端去磷酸化：
a.參考如下表格設(shè)置去磷酸化反應(yīng)：

b.按上述體系設(shè)置好之后，輕輕混勻(可以用移液器吹打混勻或用Vortex在最低速度輕輕混勻一下)，隨后離心沉淀液體至管底。
c.37℃孵育60分鐘或根據(jù)內(nèi)切酶說(shuō)明書推薦的最適條件進(jìn)行酶切反應(yīng)。
d.向酶切體系中加入1µl Antarctic Phosphatase (5U/µl)，37℃孵育15分鐘。如果希望獲取更好的去磷酸基團(tuán)效果，也可以延長(zhǎng)孵育時(shí)間至60分鐘，但通常孵育15分鐘已經(jīng)足夠。
e.75℃加熱5分鐘，對(duì)Antarctic Phosphatase和限制性內(nèi)切酶用熱失活的方法終止反應(yīng)。
f.如果后續(xù)用于連接反應(yīng)，可以使用適當(dāng)?shù)腄NA純化試劑盒(D0033)純化或DNA凝膠回收試劑盒(如D0056)進(jìn)行凝膠電泳后的切膠回收純化，也可以使用酚氯仿抽提、乙醇沉淀等方法純化已消化并且脫磷酸化的DNA或RNA。
2.DNA、RNA的5'或3'末端脫磷
a.參考如下表格設(shè)置去磷酸化反應(yīng)：

b.按上述體系設(shè)置好之后，輕輕混勻(可以用移液器吹打混勻或用Vortex在最低速度輕輕混勻一下)，隨后離心沉淀液體至管底。
c.37℃孵育15分鐘。如果希望獲取更好的去磷酸基團(tuán)效果，也可以延長(zhǎng)孵育時(shí)間至60分鐘，但通常孵育15分鐘已經(jīng)足夠。
d.75℃加熱5分鐘失活A(yù)ntarctic Phosphatase。
e.后續(xù)如有必要，可以使用適當(dāng)?shù)腄NA純化試劑盒(如D0033)純化或DNA凝膠回收試劑盒(如D0056)進(jìn)行凝膠電泳后的切膠回收純化，也可以使用酚氯仿抽提、乙醇沉淀等方法純化已消化并且脫磷酸化的DNA或RNA。
說(shuō)明：上述脫磷反應(yīng)可以用于5'突出的DNA，也可以用于平末端DNA，反應(yīng)條件相同，即均為37℃孵育15分鐘。
3.蛋白去磷酸化
a.參考如下表格設(shè)置去磷酸化反應(yīng)：

b.按上述體系設(shè)置好之后，輕輕混勻(可以用移液器吹打混勻或用Vortex在最低速度輕輕混勻一下)，隨后離心沉淀液體至管底。
c.37℃孵育60分鐘。
d.加入EDTA至終濃度為50mM或加入釩酸鈉至終濃度為10mM以終止去磷酸化反應(yīng)。
注意：酶的最佳用量和37℃的最佳孵育時(shí)間需根據(jù)特定蛋白自行進(jìn)行優(yōu)化。​