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EdU-647細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒

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 EdU-647細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒( EdU Cell Proliferation Kit with Alexa Fluor 647),是一種基于DNA合成過(guò)程中胸腺嘧啶脫氧核苷(thymidine)類(lèi)似物EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine)的摻入,并通過(guò)隨后的點(diǎn)擊反應(yīng)(Clickreaction)使EdU被Alexa Fluor 647所標(biāo)記,從而實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單、快速、高靈敏地檢測(cè)細(xì)胞增殖的試劑盒。

本試劑盒可以檢測(cè)到細(xì)胞或組織樣品中單個(gè)的增殖細(xì)胞,同時(shí)也可以對(duì)細(xì)胞或組織樣品總體的細(xì)胞增殖情況進(jìn)行定量檢測(cè)。本試劑盒可以檢測(cè)培養(yǎng)的細(xì)胞或組織樣品,也可以檢測(cè)組織切片。
經(jīng)本試劑盒處理后,增殖的細(xì)胞在激光共聚焦顯微鏡下呈現(xiàn)較強(qiáng)的遠(yuǎn)紅外熒光。通常該熒光探針被激發(fā)后,肉眼不能觀察到激發(fā)出來(lái)的長(zhǎng)波長(zhǎng)熒光,但可以被很多成像系統(tǒng)例如激光共聚焦顯微鏡等或有相應(yīng)激發(fā)和發(fā)射檢測(cè)模塊的流式細(xì)胞儀或熒光酶標(biāo)儀所檢測(cè)到,也可以用于高內(nèi)涵篩選(High-Content Screening, HCS)。流式細(xì)胞儀或熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)僅適用于細(xì)胞樣品,不適用于組織切片。
細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)是評(píng)估細(xì)胞活性、基因毒性和抗腫瘤藥物效果等的基本方法。公認(rèn)的最精確的檢測(cè)細(xì)胞增殖的方法是直接檢測(cè)細(xì)胞中DNA的合成。最初廣泛使用的通過(guò)檢測(cè)DNA合成來(lái)檢測(cè)細(xì)胞增殖的方法是放射性標(biāo)記核苷摻入法,如氚標(biāo)記胸腺嘧啶脫氧核苷([3H]thymidine)摻入法。但該方法由于有放射性污染并且很難實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞檢測(cè)而受到很大的限制,隨后逐漸被基于抗體檢測(cè)的BrdU(bromo-deoxyuridine)法所替代。BrdU法步驟繁多,且需要使用BrdU抗體,影響因素較多,穩(wěn)定性比較差。并且由于BrdU法需要使用抗體,有時(shí)會(huì)和其它目的蛋白基于抗體的檢測(cè)相互產(chǎn)生干擾。EdU法基于EdU摻入和后續(xù)的點(diǎn)擊反應(yīng),無(wú)需使用抗體、操作便捷、檢測(cè)靈敏度高,是一種在BrdU法基礎(chǔ)上升級(jí)換代的新方法,將會(huì)逐步取代BrdU法。
MTT法(C0009)、WST-1法(C0035、C0036)、CCK-8法(C0037、C0038、C0039、C0040、C0041、C0042、C0043、C0046)和CellTiter-Lumi™化學(xué)發(fā)光法(C0065、C0068)都是基于細(xì)胞活性的細(xì)胞增殖檢測(cè)方法,能檢測(cè)到細(xì)胞的總體增殖效果,但無(wú)法檢測(cè)到單個(gè)的增殖細(xì)胞。這幾種方法盡管都不是檢測(cè)DNA合成的,但被廣泛用于替代[3H]thymidine摻入法。CFDA SE法(C0051、C1031)基于細(xì)胞熒光示蹤的原理能檢測(cè)到單個(gè)的增殖細(xì)胞,但由于每增殖一次熒光減弱一半,在熒光顯微鏡下較難區(qū)分熒光減弱一半的細(xì)胞,檢測(cè)靈敏度不是很高,通常僅適用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。在進(jìn)行科學(xué)研究時(shí),上述這些基于細(xì)胞活性或CFDA SE的方法可以作為EdU法的補(bǔ)充性檢測(cè)方法。(C0051、C1031)基于細(xì)胞熒光示蹤的原理能檢測(cè)到單個(gè)的增殖細(xì)胞,但由于每增殖一次熒光減弱一半,在熒光顯微鏡下較難區(qū)分熒光減弱一半的細(xì)胞,檢測(cè)靈敏度不是很高,通常僅適用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。在進(jìn)行科學(xué)研究時(shí),上述這些基于細(xì)胞活性或CFDA SE的方法可以作為EdU法的補(bǔ)充性檢測(cè)方法。
EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine),中文名為5-乙炔基-2' -脫氧尿苷,是一種新型胸苷(胸腺嘧啶脫氧核苷,thymidine)類(lèi)似物,EdU可以在DNA合成過(guò)程中替代胸苷摻入到新合成的DNA中。另一方面,EdU上的乙炔基能與熒光標(biāo)記的小分子疊氮化物探針(如Azide Alexa Fluor 488、Azide Alexa Fluor 555、Azide Alexa Fluor 594、Azide Alexa Fluor 647等)通過(guò)一價(jià)銅離子的催化發(fā)生共價(jià)反應(yīng),形成穩(wěn)定的三唑環(huán),該反應(yīng)非常迅速,被稱(chēng)作點(diǎn)擊反應(yīng)(Click reaction),其反應(yīng)原理參見(jiàn)圖1。通過(guò)點(diǎn)擊反應(yīng),新合成的DNA會(huì)被相應(yīng)的熒光探針?biāo)鶚?biāo)記,從而可以使用適當(dāng)?shù)臒晒鈾z測(cè)設(shè)備檢測(cè)到增殖的細(xì)胞。

圖1. EdU檢測(cè)法中的點(diǎn)擊反應(yīng)(Click reaction)原理圖。熒光探針等標(biāo)記的疊氮化物(Labeled Azide)與摻入到細(xì)胞DNA中的EdU,在銅離子的催化發(fā)生共價(jià)反應(yīng),形成穩(wěn)定的三唑環(huán),最終使細(xì)胞DNA標(biāo)記上熒光探針或其它探針。

本試劑盒反應(yīng)簡(jiǎn)單、檢測(cè)靈敏度高。本試劑盒基于簡(jiǎn)單高效的點(diǎn)擊反應(yīng),無(wú)需DNA變性,只需少量的小分子疊氮化物探針即可非常有效地標(biāo)記出摻入的EdU,并且可以檢測(cè)到單個(gè)細(xì)胞的增殖情況。
本試劑盒使用便捷、兼容性好。本試劑盒只需常用的多聚甲醛固定和Triton X-100穿透,就可以使疊氮化物探針有效進(jìn)入細(xì)胞并發(fā)生點(diǎn)擊反應(yīng),不會(huì)影響細(xì)胞形態(tài),不會(huì)影響基于抗體的免疫熒光和免疫組化檢測(cè),也不會(huì)影響DNA的熒光染色(如PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期、DAPI或Hoechst染料檢測(cè)細(xì)胞核)。而B(niǎo)rdU法為了使大分子的BrdU抗體進(jìn)入細(xì)胞并與DNA上的BrdU結(jié)合,需要對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行變性處理(如酸變性、熱變性或者DNase消化等),這種變性可能會(huì)影響細(xì)胞形態(tài),影響后續(xù)的免疫熒光和免疫組化檢測(cè)、DNA的熒光染色等。BrdU法和 EdU法檢測(cè)原理的比較參見(jiàn)圖2。

圖2. BrdU法和 EdU法檢測(cè)原理的比較。A. BrdU法需使用大分子的BrdU抗體,由于空間位阻,雙鏈DNA須變性后才能使BrdU抗體與BrdU結(jié)合。B. EdU法使用小分子標(biāo)記的疊氮化物(Azide),無(wú)需DNA變性,操作更便捷,兼容性好,檢測(cè)結(jié)果更加穩(wěn)定可靠。

本試劑盒檢測(cè)快速。相對(duì)于至少需要4小時(shí)的BrdU法,本試劑盒采用的 EdU法檢測(cè)新合成的DNA只需1.5-2小時(shí), 時(shí)間上大大縮短。本試劑盒同時(shí)提供了染色細(xì)胞核的Hoechst 33342,以方便染色觀察所有的細(xì)胞核?梢允褂脽晒怙@微鏡或流式細(xì)胞儀等進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。Jurkat細(xì)胞用本試劑盒和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖的效果參見(jiàn)圖3。

圖3. Jurkat細(xì)胞用本試劑盒標(biāo)記后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖的效果圖。Jurkat細(xì)胞只用EdU標(biāo)記(左圖),或在標(biāo)記的同時(shí)用10mM的DNA合成抑制劑羥基脲(Hydroxyurea)處理(右圖),2小時(shí)后用本試劑盒進(jìn)行點(diǎn)擊反應(yīng),然后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。從圖中可以看出,僅EdU標(biāo)記的細(xì)胞有較高比例的遠(yuǎn)紅外熒光(647 fluorescence)陽(yáng)性細(xì)胞,呈現(xiàn)遠(yuǎn)紅外熒光陰性(弱染色)和陽(yáng)性(強(qiáng)染色)的兩個(gè)峰(左圖),分別對(duì)應(yīng)于未增殖細(xì)胞和增殖細(xì)胞。經(jīng)過(guò)羥基脲處理的細(xì)胞,遠(yuǎn)紅外熒光陽(yáng)性的細(xì)胞幾乎完全消失(右圖),僅剩下一個(gè)遠(yuǎn)紅外熒光陰性的峰(右圖)。該檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明DNA合成被抑制后,EdU的摻入也被抑制。實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)可能會(huì)因細(xì)胞類(lèi)型、細(xì)胞增殖情況、檢測(cè)儀器等的不同而存在差異,圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

各種細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒的比較和選擇,請(qǐng)參考 http://www.beyotime.com/cell-proliferation.htm。
本試劑盒小包裝C0081S如果用于培養(yǎng)的細(xì)胞(6孔板)的檢測(cè),可以檢測(cè)50個(gè)樣品,每個(gè)樣品的反應(yīng)體系為500μl的Click反應(yīng)液;如果用于96孔板檢測(cè),可以檢測(cè)500個(gè)樣品,每個(gè)樣品的檢測(cè)體系為50μl的Click反應(yīng)液;如果用于12孔、24孔、48孔或384孔板樣品的檢測(cè),分別可以檢測(cè)125、250、350和1250個(gè)樣品,每個(gè)樣品推薦的Click反應(yīng)液用量為200μl、100μl、70μl和20μl。小包裝如果用于流式細(xì)胞儀檢測(cè),可以檢測(cè)50個(gè)樣品,每個(gè)細(xì)胞樣品的細(xì)胞數(shù)量宜為10-100萬(wàn),每個(gè)樣品的反應(yīng)體系為500μl的Click反應(yīng)液。小包裝如果用于冰凍或石蠟切片的檢測(cè),可以檢測(cè)125-250個(gè)樣品, 每個(gè)樣品的反應(yīng)體系為100-200μl的Click反應(yīng)液。大包裝C0081L可檢測(cè)樣品的數(shù)量為小包裝C0081S的4倍。
包裝清單:

產(chǎn)品編號(hào) 產(chǎn)品名稱(chēng) 包裝
C0081S-1 EdU (10mM) 200μl
C0081S-2 Azide 647 55μl
C0081S-3 Click Reaction Buffer 30ml
C0081S-4 CuSO4 1.1ml
C0081S-5 Click Additive 2管
C0081S-6 Hoechst 33342 (1000X) 50μl
說(shuō)明書(shū) 1份

保存條件:
-20℃保存,一年有效。Azide 647和Hoechst 33342須避光保存。
注意事項(xiàng):
Click Additive配制成溶液后請(qǐng)注意適當(dāng)分裝。如果溶解后有白色物質(zhì)析出,請(qǐng)上下顛倒多次,待全部溶解后使用。如果該溶液顏色變成棕色,說(shuō)明該組分的有效成分已失效,請(qǐng)棄用。

2.檢測(cè)體系的準(zhǔn)備
a.如下以6孔板或常規(guī)切片檢測(cè)體系為例,如果使用12孔板、96孔板或384孔板等孔板,檢測(cè)體系可以相應(yīng)按比例縮小。
b.如果檢測(cè)的是懸浮細(xì)胞,請(qǐng)按常規(guī)的懸浮細(xì)胞的操作方式進(jìn)行。例如和貼壁細(xì)胞相比,相關(guān)步驟需要增加離心步驟等,如1000×g室溫離心5min。
3.培養(yǎng)細(xì)胞的EdU標(biāo)記及固定、洗滌和通透
a.在6孔板中(如有必要可以加入蓋玻片)培養(yǎng)適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜并且恢復(fù)到正常狀態(tài)后,進(jìn)行所需的藥物處理或者其它刺激處理等。
b.配制2X的EdU工作液:由于EdU工作液是與培養(yǎng)液等體積加入到孔板中,所以需要配制成2X的工作液。推薦的EdU終濃度為10μM (1X),用細(xì)胞培養(yǎng)液1:500稀釋EdU (10mM)即可得到2X的EdU工作液(20μM)。
注意:對(duì)于A549、HeLa和NIH/3T3等貼壁細(xì)胞,推薦EdU的使用終濃度為10μM。但細(xì)胞類(lèi)型、培養(yǎng)液種類(lèi)、細(xì)胞密度、細(xì)胞增殖速度等多方面的因素會(huì)影響EdU摻入到細(xì)胞中的量,因此初次使用時(shí)建議對(duì)EdU的使用濃度進(jìn)行一定的摸索。如果之前使用過(guò)BrdU進(jìn)行實(shí)驗(yàn),則可以參考BrdU的終濃度作為EdU的終濃度。
c.將37℃預(yù)熱的2X的EdU工作液(20μM),等體積加入6孔板中,使6孔板中的EdU終濃度變?yōu)?X。例如設(shè)計(jì)終濃度為10μM,原先6孔板中的培養(yǎng)基為1ml,則將1ml 2X的EdU工作液(20μM)加入到孔板中。如果培養(yǎng)基體積過(guò)大,可以先吸除適量的培養(yǎng)液,再加入等體積的2X的EdU工作液;或者可以減少工作液的體積并增加EdU的濃度,使最終培養(yǎng)液中的EdU濃度為10μM,例如2ml培養(yǎng)液中加入220微升0.1mM EdU。更換所有的培養(yǎng)液可能會(huì)對(duì)細(xì)胞的增殖有影響,因此不建議替換所有的培養(yǎng)液。
d.繼續(xù)孵育細(xì)胞2小時(shí)。該孵育時(shí)間的長(zhǎng)短取決于細(xì)胞生長(zhǎng)速率,通常宜繼續(xù)孵育細(xì)胞周期10%左右的時(shí)間。對(duì)于常見(jiàn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞如HeLa、3T3、HEK293等,細(xì)胞周期大約在18-25小時(shí),孵育時(shí)間宜在2小時(shí)左右。人胚胎細(xì)胞的細(xì)胞周期約30分鐘,推薦的孵育時(shí)間為5分鐘;酵母細(xì)胞的細(xì)胞周期約3小時(shí),推薦的孵育時(shí)間為20分鐘,增殖的神經(jīng)細(xì)胞其細(xì)胞周期約5天,推薦的孵育時(shí)間為1天。孵育時(shí)間小于45分鐘時(shí),建議提高EdU的濃度;孵育時(shí)間大于20小時(shí)時(shí),建議適當(dāng)降低EdU的濃度。
e.EdU標(biāo)記細(xì)胞完成后,去除培養(yǎng)液,并加入1ml固定液(可以使用免疫染色固定液P0098,或4%的多聚甲醛P0099),室溫固定15分鐘。注:對(duì)于流式細(xì)胞儀檢測(cè),貼壁細(xì)胞胰酶消化后用培養(yǎng)液重懸后再固定。
f.去除固定液,每孔用1ml洗滌液洗滌細(xì)胞3次,每次3-5分鐘。
g.去除洗滌液,每孔用1ml通透液(可以使用免疫染色強(qiáng)力通透液P0097,免疫染色洗滌液P0106,或含0.3% Triton X-100的PBS),室溫孵育10-15分鐘。
h.去除通透液,每孔用1ml洗滌液洗滌細(xì)胞1-2次,每次3-5分鐘。
i.轉(zhuǎn)步驟5。
4.動(dòng)物體內(nèi)EdU的標(biāo)記及切片樣品的處理
EdU可以通過(guò)注射或進(jìn)食等適當(dāng)方式進(jìn)行動(dòng)物的體內(nèi)標(biāo)記。如下以小鼠為例,其它動(dòng)物體內(nèi)EdU的標(biāo)記請(qǐng)參考相關(guān)文獻(xiàn)。
a.對(duì)于小鼠,可以按照10-200mg/kg的用量,把EdU用PBS配制成一定濃度,腹腔注射、特定組織或器官局部注射或者加入飲用水中。具體用量跟所用動(dòng)物的種類(lèi)、體重和使用方式有關(guān),可以參考相關(guān)文獻(xiàn),因此初次使用時(shí)建議對(duì)EdU的使用濃度進(jìn)行一定的摸索,或者直接使用50mg/kg的濃度進(jìn)行測(cè)試。如果之前使用過(guò)BrdU進(jìn)行實(shí)驗(yàn),則可以參考BrdU的終濃度作為EdU的終濃度。EdU可以單獨(dú)購(gòu)買(mǎi)ST067。
b.4小時(shí)后或根據(jù)特定實(shí)驗(yàn)確定的適當(dāng)時(shí)間后,快速處死小鼠,取出所需的組織,按照常規(guī)步驟制作冰凍切片或石蠟切片。EdU標(biāo)記的時(shí)間也可以參考相關(guān)文獻(xiàn)自行調(diào)整。
c.對(duì)于冰凍切片:
(a)加入適量固定液(可以使用免疫染色固定液P0098,或4%的多聚甲醛P0099),室溫固定15分鐘。
(b)去除固定液,用適量洗滌液洗滌3次,每次3-5分鐘。
(c)去除洗滌液,用適量通透液(可以使用免疫染色強(qiáng)力通透液P0097,免疫染色洗滌液P0106,或含0.3% Triton X-100的PBS),室溫孵育10-15分鐘。
(d)去除通透液,用適量洗滌液洗滌1-2次,每次3-5分鐘。
(e)抗原修復(fù)(選做):如果同時(shí)需要進(jìn)行目的蛋白的免疫熒光染色,并有必要進(jìn)行抗原修復(fù),可以使用適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)液,例如P0090冰凍切片快速抗原修復(fù)液(5X),或者自行配制的適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)處理。
(f)轉(zhuǎn)步驟5。
d.對(duì)于石蠟切片:
(a)脫蠟:二甲苯中脫蠟5-10分鐘。換用新鮮的二甲苯,再脫蠟5-10分鐘。無(wú)水乙醇5分鐘,換新的無(wú)水乙醇3分鐘。95%乙醇3分鐘。85%乙醇3分鐘。75%乙醇3分鐘。50%乙醇3分鐘。PBS 5分鐘。
(b)抗原修復(fù)(選做):如果同時(shí)需要進(jìn)行目的蛋白的免疫組化染色,可以使用適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)液,例如P0081檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(50X)、P0083改進(jìn)型檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(50X)、P0085 EDTA抗原修復(fù)液(50X)、P0086檸檬酸鈉-EDTA抗原修復(fù)液(40X)、P0088通用型強(qiáng)力抗原修復(fù)液(10X)、P0092漂片抗原修復(fù)液(10X),或者自行配制適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)處理。
特別注意:如果使用蛋白酶K或胰酶進(jìn)行抗原修復(fù),必須反復(fù)洗滌干凈,否則殘留的酶會(huì)嚴(yán)重干擾后續(xù)標(biāo)記反應(yīng)。
(c)轉(zhuǎn)步驟5。
5.EdU檢測(cè)
注意:本步驟六孔板中每孔的反應(yīng)體系為500μl的反應(yīng)混合物。對(duì)于12、24、48、96和384孔板,每孔的反應(yīng)的體系分別為200μl、100μl、70μl、50μl和20μl的反應(yīng)混合物。對(duì)于較小的孔,單位培養(yǎng)面積的液體用量已經(jīng)適當(dāng)增加,以有效避免液體蒸發(fā)可能帶來(lái)的負(fù)面影響。對(duì)于切片,可以根據(jù)切片大小,每個(gè)切片使用100-200μl的反應(yīng)混合物。如下以六孔板中的細(xì)胞樣品為例說(shuō)明具體的操作方法,對(duì)于其它孔板或切片,僅每步溶液的用量按比例調(diào)整即可,其余方法相同。
a.配制Click Additive Solution:對(duì)于C0078S,用1.3ml去離子水溶解一管Click Additive,混勻至全部溶解,即為Click Additive Solution;對(duì)于C0078L,加入10.4ml去離子水溶解試劑盒中提供的一瓶Click Additive,混勻至全部溶解,即為Click Additive Solution。配制后可以適當(dāng)分裝,并-20℃保存。
b.參考下表配制Click反應(yīng)液。注意:請(qǐng)嚴(yán)格按照下表中組分順序和體積配制Click反應(yīng)液,否則點(diǎn)擊反應(yīng)可能無(wú)法有效進(jìn)行;同時(shí),Click反應(yīng)液須在配制后15分鐘內(nèi)使用。

組分 6孔板樣品數(shù)
1 2 4 5 10 25 50
Click Reaction Buffer 430μl 860μl 1.72ml 2.15ml 4.3ml 10.75ml 21.5ml
CuSO4 20μl 40μl 80μl 100μl 200μl 500μl 1ml
Azide 647 1μl 2μl 4μl 5μl 10μl 25μl 50μl
Click Additive Solution 50μl 100μl 200μl 250μl 500μl 1.25ml 2.5ml
總體積 500μl 1ml 2ml 2.5ml 5ml 12.5ml 25ml

c.去除上一步驟中的洗滌液。
d.每孔加入0.5ml Click反應(yīng)液,輕輕搖晃培養(yǎng)板以確保反應(yīng)混合物可以均勻覆蓋樣品。
e.室溫避光孵育30分鐘。
f.吸除Click反應(yīng)液,用洗滌液洗滌3次,每次3-5分鐘。
g.如果需要對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色,可以參照步驟6進(jìn)行。如無(wú)其它的特殊需要,即可在可以檢測(cè)遠(yuǎn)紅外熒光的熒光顯微鏡下觀察,或者使用相應(yīng)的流式細(xì)胞儀、多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光檢測(cè),或者用高內(nèi)涵篩選儀器(一般高內(nèi)涵篩選需要使用染料對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色)進(jìn)行檢測(cè)。Azide 647的最大激發(fā)波長(zhǎng)是650nm,最大發(fā)射波長(zhǎng)是670nm。
6.細(xì)胞核染色
為了檢測(cè)細(xì)胞增殖的比例,可以考慮使用Hoechst 33342進(jìn)行細(xì)胞核染色。一般高內(nèi)涵篩選儀器也需要對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。
a.1X Hoechst 33342溶液的配制:按1:1000比例用PBS稀釋Hoechst 33342 (1000X)。
b.接上述步驟5g,吸除洗滌液后,每孔加1X Hoechst 33342溶液1ml,室溫避光孵育10分鐘。
c.吸除1X Hoechst 33342溶液。
d.用洗滌液洗滌3次,每次3-5分鐘。
e.隨后即可進(jìn)行熒光檢測(cè)。Hoechst 33342為藍(lán)色熒光,最大激發(fā)波長(zhǎng)為346nm,最大發(fā)射波長(zhǎng)為460nm。
7.流式細(xì)胞儀檢測(cè)
對(duì)于經(jīng)步驟5或6獲得的細(xì)胞懸液樣品進(jìn)行流式檢測(cè)。如果使用傳統(tǒng)的流體動(dòng)力學(xué)聚焦的流式細(xì)胞儀來(lái)測(cè)量總DNA含量,請(qǐng)?jiān)跈z測(cè)過(guò)程中使用低流速,實(shí)驗(yàn)中的每個(gè)樣品應(yīng)使用相同的收集速率和細(xì)胞濃度。EdU標(biāo)記產(chǎn)生的熒光信號(hào)一般使用對(duì)數(shù)刻度的橫坐標(biāo)(如圖3中的橫坐標(biāo))。Azide 647的最大激發(fā)波長(zhǎng)是650nm,最大發(fā)射波長(zhǎng)是670nm。
注1:建議使用未經(jīng)EdU標(biāo)記的細(xì)胞樣品作為流式細(xì)胞儀檢測(cè)的陰性對(duì)照,并選擇合適的電壓。
注2:由于流式細(xì)胞儀檢測(cè)比較靈敏,可根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型和實(shí)際染色情況對(duì)Azide 647的使用量進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。

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