EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒(DAB法)(EdU Cell Proliferation Kit with DAB),是一種基于DNA合成過程中胸腺嘧啶脫氧核苷(thymidine)類似物EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine)的摻入,并通過隨后的點(diǎn)擊反應(yīng)(Click reaction)使EdU被生物素(Biotin)所標(biāo)記,然后加入的辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素(HRP-Streptavidin)與生物素結(jié)合,最后通過DAB顯色,從而實(shí)現(xiàn)簡單、快速、高靈敏地檢測細(xì)胞增殖的試劑盒。
本試劑盒可以檢測到細(xì)胞或組織樣品中單個(gè)的增殖細(xì)胞,同時(shí)也可以對細(xì)胞或組織樣品總體的細(xì)胞增殖情況進(jìn)行定量檢測。本試劑盒可以檢測培養(yǎng)的細(xì)胞或組織樣品,也可以檢測組織切片,但均需提前進(jìn)行EdU的摻入。
細(xì)胞增殖能力的檢測是評(píng)估細(xì)胞活性、基因毒性和抗腫瘤藥物效果等的基本方法。公認(rèn)的最精確的檢測細(xì)胞增殖的方法是直接檢測細(xì)胞中DNA的合成。最初廣泛使用的通過檢測DNA合成來檢測細(xì)胞增殖的方法是放射性標(biāo)記核苷摻入法,如氚標(biāo)記胸腺嘧啶脫氧核苷([3H]thymidine)摻入法。但該方法由于有放射性污染并且很難實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞檢測而受到很大的限制,隨后逐漸被基于抗體檢測的BrdU(bromo-deoxyuridine)法所替代。BrdU法步驟繁多,且需要使用BrdU抗體,影響因素較多,穩(wěn)定性比較差。并且由于BrdU法需要使用抗體,有時(shí)會(huì)和其它目的蛋白基于抗體的檢測相互產(chǎn)生干擾。EdU法基于EdU摻入和后續(xù)的點(diǎn)擊反應(yīng),無需使用抗體、操作便捷、檢測靈敏度高,是一種在BrdU法基礎(chǔ)上升級(jí)換代的新方法,將會(huì)逐步取代BrdU法。
MTT法(C0009)、WST-1法(C0035、C0036)、CCK-8法(C0037、C0038、C0039、C0040、C0041、C0042、C0043、C0046)和CellTiter-Lumi™化學(xué)發(fā)光法(C0065、C0068)都是基于細(xì)胞活性的細(xì)胞增殖檢測方法,能檢測到細(xì)胞的總體增殖效果,但無法檢測到單個(gè)的增殖細(xì)胞。這幾種方法盡管都不是檢測DNA合成的,但被廣泛用于替代[3H]thymidine摻入法。CFDA SE法(C0051、C1031)基于細(xì)胞熒光示蹤的原理能檢測到單個(gè)的增殖細(xì)胞,但由于每增殖一次熒光減弱一半,在熒光顯微鏡下較難區(qū)分熒光減弱一半的細(xì)胞,檢測靈敏度不是很高,通常僅適用于流式細(xì)胞儀檢測。在進(jìn)行科學(xué)研究時(shí),上述這些基于細(xì)胞活性或CFDA SE的方法可以作為EdU法的補(bǔ)充性檢測方法。
EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine),中文名為5-乙炔基-2' -脫氧尿苷,是一種新型胸苷(胸腺嘧啶脫氧核苷,thymidine)類似物,EdU可以在DNA合成過程中替代胸苷摻入到新合成的DNA中。另一方面,EdU上的乙炔基能與生物素標(biāo)記的疊氮化物(Biotin labeled azide)通過一價(jià)銅離子的催化發(fā)生共價(jià)反應(yīng),形成穩(wěn)定的三唑環(huán),該反應(yīng)非常迅速,被稱作點(diǎn)擊反應(yīng)(Click reaction),其反應(yīng)原理參見圖1。通過點(diǎn)擊反應(yīng),新合成的DNA會(huì)被相應(yīng)的生物素探針?biāo)鶚?biāo)記,從而可以使用適當(dāng)?shù)臋z測設(shè)備檢測到增殖的細(xì)胞。
圖1. EdU檢測法中的點(diǎn)擊反應(yīng)(Click reaction)原理圖。生物素或熒光探針等標(biāo)記的疊氮化物(Labeled Azide)與摻入到細(xì)胞DNA中的EdU,在銅離子的催化發(fā)生共價(jià)反應(yīng),形成穩(wěn)定的三唑環(huán),最終使細(xì)胞DNA標(biāo)記上生物素等探針。
本試劑盒反應(yīng)簡單、檢測靈敏度高。本試劑盒基于簡單高效的點(diǎn)擊反應(yīng),無需DNA變性,只需少量的小分子疊氮化物探針即可非常有效地標(biāo)記出摻入的EdU,并且可以檢測到單個(gè)細(xì)胞的增殖情況。
本試劑盒使用便捷、兼容性好。本試劑盒只需常用的多聚甲醛固定和Triton X-100穿透,就可以使疊氮化物探針有效進(jìn)入細(xì)胞并發(fā)生點(diǎn)擊反應(yīng),不會(huì)影響細(xì)胞形態(tài),不會(huì)影響基于抗體的免疫熒光和免疫組化檢測,也不會(huì)影響DNA的熒光染色(如PI染色檢測細(xì)胞周期、DAPI或Hoechst染料檢測細(xì)胞核)。而BrdU法為了使大分子的BrdU抗體進(jìn)入細(xì)胞并與DNA上的BrdU結(jié)合,需要對雙鏈DNA進(jìn)行變性處理(如酸變性、熱變性或者DNase消化等),這種變性可能會(huì)影響細(xì)胞形態(tài),影響后續(xù)的免疫熒光和免疫組化檢測、DNA的熒光染色等。BrdU法和 EdU法檢測原理的比較參見圖2。
圖2. BrdU法和 EdU法檢測原理的比較。A. BrdU法需使用大分子的BrdU抗體,由于空間位阻,雙鏈DNA須變性后才能使BrdU抗體與BrdU結(jié)合。B. EdU法使用小分子標(biāo)記的疊氮化物(Azide),無需DNA變性,操作更便捷,兼容性好,檢測結(jié)果更加穩(wěn)定可靠。
本試劑盒檢測快速。相對于BrdU法,本試劑盒采用 EdU法檢測新合成的DNA,所需時(shí)間顯著縮短。
經(jīng)本試劑盒處理后,增殖的細(xì)胞呈棕色,可以用普通光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。HeLa細(xì)胞用本試劑盒檢測細(xì)胞增殖的效果參見圖3。
圖3. HeLa細(xì)胞用本試劑盒檢測細(xì)胞增殖的效果圖。無EdU組觀察不到棕色染色(最左側(cè)一列);EdU (10μM)孵育2小時(shí)組有明顯的棕色染色(中間一列);而用10mM的DNA合成抑制劑羥基脲(Hydroxyurea)提前預(yù)處理0.5小時(shí)后,棕色染色顯著減弱,說明DNA合成被抑制后,EdU的摻入被顯著抑制(最右側(cè)一列)。
各種細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測試劑盒的比較和選擇,請參考 http://www.beyotime.com/cell-proliferation.htm。
本試劑盒小包裝C0085S如果用于培養(yǎng)的細(xì)胞(6孔板)的檢測,可以檢測50個(gè)樣品,每個(gè)樣品的反應(yīng)體系為500μl的Click反應(yīng)液;如果用于96孔板檢測,可以檢測500個(gè)樣品,每個(gè)樣品的檢測體系為50μl的Click反應(yīng)液;如果用于12孔、24孔、48孔或384孔板樣品的檢測,分別可以檢測125、250、350和1250個(gè)樣品,每個(gè)樣品推薦的Click反應(yīng)液用量為200μl、100μl、70μl和20μl。小包裝如果用于冰凍或石蠟切片的檢測,可以檢測125-250個(gè)樣品,每個(gè)樣品的反應(yīng)體系為100-200μl的Click反應(yīng)液。大包裝C0085L可檢測樣品的數(shù)量為小包裝C0085S的4倍。
包裝清單:
產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
C0085S-1 | EdU (10mM) | 200μl |
C0085S-2 | Biotin Azide | 55μl |
C0085S-3 | Click Reaction Buffer | 30ml |
C0085S-4 | CuSO4 | 0.6ml |
C0085S-5 | Click Additive | 2管 |
C0085S-6 | Streptavidin-HRP | 220μl |
C0085S-7 | Streptavidin-HRP稀釋液 | 10ml |
C0085S-8 | DAB顯色液A | 10ml |
C0085S-9 | DAB顯色液B | 10ml |
— | 說明書 | 1份 |
保存條件:
-20℃保存,一年有效。Biotin Azide、DAB顯色液A和DAB顯色液B須避光保存。
注意事項(xiàng):
Click Additive配制成溶液后請注意適當(dāng)分裝。如果溶解后有白色物質(zhì)析出,請上下顛倒多次,待全部溶解后使用。如果該溶液顏色變成棕色,說明該組分的有效成分已失效,請棄用。
DAB對人體有害,操作時(shí)請小心,并注意有效防護(hù)以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。
f. 去離子水或超純水。
g. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求:18×18mm蓋玻片,6孔板或其它多孔板。
2. 檢測體系的準(zhǔn)備
a. 如下以6孔板或常規(guī)切片檢測體系為例,如果使用12孔板、96孔板或384孔板等孔板,檢測體系可以相應(yīng)按比例縮小。
b. 如果檢測的是懸浮細(xì)胞,請按常規(guī)的懸浮細(xì)胞的操作方式進(jìn)行。例如和貼壁細(xì)胞相比,相關(guān)步驟需要增加離心步驟等。
3. 培養(yǎng)細(xì)胞的EdU標(biāo)記及固定、洗滌和通透
a. 在6孔板中(如有必要可以加入蓋玻片)培養(yǎng)適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)過夜并且恢復(fù)到正常狀態(tài)后,進(jìn)行所需的藥物處理或者其它刺激處理等。
b. 配制2X的EdU工作液:由于EdU工作液是與培養(yǎng)液等體積加入到孔板中,所以需要配制成2X的工作液。推薦的EdU終濃度為10μM (1X),用細(xì)胞培養(yǎng)液1:500稀釋EdU (10mM)即可得到2X的EdU工作液(20μM)。
注意:對于A549、HeLa和NIH/3T3等貼壁細(xì)胞,推薦EdU的使用終濃度為10μM。但細(xì)胞類型、培養(yǎng)液種類、細(xì)胞密度、細(xì)胞增殖速度等多方面的因素會(huì)影響EdU摻入到細(xì)胞中的量,因此初次使用時(shí)建議對EdU的使用濃度進(jìn)行一定的摸索。如果之前使用過BrdU進(jìn)行實(shí)驗(yàn),則可以參考BrdU的終濃度作為EdU的終濃度。
c. 將37℃預(yù)熱的2X的EdU工作液(20μM),等體積加入6孔板中,使6孔板中的EdU終濃度變?yōu)?X。例如設(shè)計(jì)終濃度為10μM,原先6孔板中的培養(yǎng)基為1ml,則將1ml 2X的EdU工作液(20μM)加入到孔板中。如果培養(yǎng)基體積過大,可以先吸除適量的培養(yǎng)液,再加入等體積的2X的EdU工作液;或者可以減少工作液的體積并增加EdU的濃度,使最終培養(yǎng)液中的EdU濃度為10μM,例如2ml培養(yǎng)液中加入220微升0.1mM EdU。更換所有的培養(yǎng)液可能會(huì)對細(xì)胞的增殖有影響,因此不建議替換所有的培養(yǎng)液。
d. 繼續(xù)孵育細(xì)胞2小時(shí)。該孵育時(shí)間的長短取決于細(xì)胞生長速率,通常宜繼續(xù)孵育細(xì)胞周期10%左右的時(shí)間。對于常見的哺乳動(dòng)物細(xì)胞如HeLa、3T3、HEK293等,細(xì)胞周期大約在18-25小時(shí),孵育時(shí)間宜在2小時(shí)左右。人胚胎細(xì)胞的細(xì)胞周期約30分鐘,推薦的孵育時(shí)間為5分鐘;酵母細(xì)胞的細(xì)胞周期約3小時(shí),推薦的孵育時(shí)間為20分鐘,增殖的神經(jīng)細(xì)胞其細(xì)胞周期約5天,推薦的孵育時(shí)間為1天。孵育時(shí)間小于45分鐘時(shí),建議提高EdU的濃度;孵育時(shí)間大于20小時(shí)時(shí),建議適當(dāng)降低EdU的濃度。
e. EdU標(biāo)記細(xì)胞完成后,去除培養(yǎng)液,并加入1ml固定液(可以使用免疫染色固定液P0098,或4%的多聚甲醛P0099),室溫固定15分鐘。
f. 去除固定液,每孔用1ml洗滌液洗滌細(xì)胞3次,每次3-5分鐘。
g. 去除洗滌液,每孔用1ml通透液(可以使用免疫染色強(qiáng)力通透液P0097,免疫染色洗滌液P0106,或含0.3% Triton X-100的PBS),室溫孵育10-15分鐘。
h. 去除通透液,每孔用1ml洗滌液洗滌細(xì)胞1-2次,每次3-5分鐘。
i. 再用內(nèi)源性過氧化物酶封閉液室溫孵育20分鐘,以滅活內(nèi)源的過氧化物酶。隨后用洗滌液洗滌3次,每次2分鐘。
j. 轉(zhuǎn)步驟5。
4. 動(dòng)物體內(nèi)EdU的標(biāo)記及切片樣品的處理
EdU可以通過注射或進(jìn)食等適當(dāng)方式進(jìn)行動(dòng)物的體內(nèi)標(biāo)記。如下以小鼠為例,其它動(dòng)物體內(nèi)EdU的標(biāo)記請參考相關(guān)文獻(xiàn)。
a. 對于小鼠,可以按照10-200mg/kg的用量,把EdU用PBS配制成一定濃度,腹腔注射、特定組織或器官局部注射或者加入飲用水中。具體用量跟所用動(dòng)物的種類、體重和使用方式有關(guān),可以參考相關(guān)文獻(xiàn),因此初次使用時(shí)建議對EdU的使用濃度進(jìn)行一定的摸索,或者直接使用50mg/kg的濃度進(jìn)行測試。如果之前使用過BrdU進(jìn)行實(shí)驗(yàn),則可以參考BrdU的終濃度作為EdU的終濃度。EdU可以單獨(dú)購買ST067。
b. 4小時(shí)后或根據(jù)特定實(shí)驗(yàn)確定的適當(dāng)時(shí)間后,快速處死小鼠,取出所需的組織,按照常規(guī)步驟制作冰凍切片或石蠟切片。EdU標(biāo)記的時(shí)間也可以參考相關(guān)文獻(xiàn)自行調(diào)整。
c. 對于冰凍切片:
(a) 加入適量固定液(可以使用免疫染色固定液P0098,或4%的多聚甲醛P0099),室溫固定15分鐘。
(b) 去除固定液,用適量洗滌液洗滌3次,每次3-5分鐘。
(c) 去除洗滌液,用適量通透液(可以使用免疫染色強(qiáng)力通透液P0097,免疫染色洗滌液P0106,或含0.3% Triton X-100的PBS),室溫孵育10-15分鐘。
(d) 去除通透液,用適量洗滌液洗滌1-2次,每次3-5分鐘。
(e) 抗原修復(fù)(選做):如果同時(shí)需要進(jìn)行目的蛋白的免疫熒光染色,并有必要進(jìn)行抗原修復(fù),可以使用適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)液,例如P0090冰凍切片快速抗原修復(fù)液(5X),或者自行配制的適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)處理。
(f) 用內(nèi)源性過氧化物酶封閉液室溫孵育20分鐘,以滅活切片內(nèi)源的過氧化物酶。隨后用洗滌液洗滌3次,每次2分鐘。
(g) 轉(zhuǎn)步驟5。
d. 對于石蠟切片:
(a) 脫蠟:二甲苯中脫蠟5-10分鐘。換用新鮮的二甲苯,再脫蠟5-10分鐘。無水乙醇5分鐘,換新的無水乙醇3分鐘。95%乙醇3分鐘。85%乙醇3分鐘。75%乙醇3分鐘。50%乙醇3分鐘。PBS 5分鐘。
(b) 抗原修復(fù)(選做):如果同時(shí)需要進(jìn)行目的蛋白的免疫組化染色,可以使用適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)液,例如P0081檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(50X)、P0083改進(jìn)型檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(50X)、P0085 EDTA抗原修復(fù)液(50X)、P0086檸檬酸鈉-EDTA抗原修復(fù)液(40X)、P0088通用型強(qiáng)力抗原修復(fù)液(10X)、P0092漂片抗原修復(fù)液(10X),或者自行配制適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)處理。
特別注意:如果使用蛋白酶K或胰酶進(jìn)行抗原修復(fù),必須反復(fù)洗滌干凈,否則殘留的酶會(huì)嚴(yán)重干擾后續(xù)標(biāo)記反應(yīng)。
(c) 用內(nèi)源性過氧化物酶封閉液室溫孵育20分鐘,以滅活切片內(nèi)源的過氧化物酶。隨后用洗滌液洗滌3次,每次2分鐘。
(d) 轉(zhuǎn)步驟5。
5. EdU檢測
注意:本步驟六孔板中每孔的反應(yīng)體系為500μl的反應(yīng)混合物。對于12、24、48、96和384孔板,每孔的反應(yīng)的體系分別為200μl、100μl、70μl、50μl和20μl的反應(yīng)混合物。對于較小的孔,單位培養(yǎng)面積的液體用量已經(jīng)適當(dāng)增加,以有效避免液體蒸發(fā)可能帶來的負(fù)面影響。對于切片,可以根據(jù)切片大小,每個(gè)切片使用100-200μl的反應(yīng)混合物。如下以六孔板中的細(xì)胞樣品為例說明具體的操作方法,對于其它孔板或切片,僅每步溶液的用量按比例調(diào)整即可,其余方法相同。
a. 配制Click Additive Solution:對于C0085S,用1.3ml去離子水溶解一管Click Additive,混勻至全部溶解,即為Click Additive Solution;對于C0085L,加入10.4ml去離子水溶解試劑盒中提供的一瓶Click Additive,混勻至全部溶解,即為Click Additive Solution。配制后可以適當(dāng)分裝,并-20℃保存。
b. 參考下表配制Click反應(yīng)液。注意:請嚴(yán)格按照下表中組分順序和體積配制Click反應(yīng)液,否則點(diǎn)擊反應(yīng)可能無法有效進(jìn)行;同時(shí),Click反應(yīng)液須在配制后15分鐘內(nèi)使用。
組分 | 6孔板樣品數(shù) | ||||||
1 | 2 | 4 | 5 | 10 | 25 | 50 | |
Click Reaction Buffer | 440μl | 880μl | 1.8ml | 2.2ml | 4.4ml | 11ml | 22ml |
CuSO4 | 10μl | 20μl | 40μl | 50μl | 100μl | 250μl | 500μl |
Biotin Azide | 1μl | 2μl | 4μl | 5μl | 10μl | 25μl | 50μl |
Click Additive Solution | 50μl | 100μl | 200μl | 250μl | 500μl | 1.25ml | 2.5ml |
總體積 | 500μl | 1ml | 2ml | 2.5ml | 5ml | 12.5ml | 25ml |
c. 去除上一步驟中的洗滌液。
d. 每孔加入0.5ml Click反應(yīng)液,輕輕搖晃培養(yǎng)板以確保反應(yīng)混合物可以均勻覆蓋樣品。
e. 室溫避光孵育30分鐘。孵育時(shí)需注意在多孔板的空隙中加水,或者對于切片宜使用濕盒(例如載玻片染色盒FSR958)來保持濕潤,以盡量減少反應(yīng)液的蒸發(fā)。
f. 吸除Click反應(yīng)液,用洗滌液洗滌3次,每次3-5分鐘。
6. Streptavidin-HRP工作液和DAB顯色液的配制:
a. Streptavidin-HRP工作液的配制:
參考下表配制適量的Streptavidin-HRP工作液,須充分混勻。注意:配制好的Streptavidin-HRP工作液必須一次使用完畢,不宜凍存。
組分 | 6孔板樣品數(shù) | ||||||
1 | 2 | 4 | 5 | 10 | 25 | 50 | |
Streptavidin-HRP | 4μl | 8μl | 16μl | 20μl | 40μl | 100μl | 200μl |
Streptavidin-HRP稀釋液 | 196μl | 392μl | 784μl | 980μl | 1.96ml | 4.9ml | 9.8ml |
Streptavidin-HRP工作液 | 200μl | 400μl | 800μl | 1ml | 2ml | 5ml | 10ml |
b. DAB顯色液的配制:
按照每個(gè)樣品使用0.2-0.4ml顯色液的比例配制適量DAB顯色液。等體積混合適量DAB顯色液A和DAB顯色液B,充分混勻后即為DAB顯色液。注意:配制好的DAB顯色液必須一次使用完畢,不宜凍存。
7. 樣品的顯色:
a. 在樣品上加200μl Streptavidin-HRP工作液,室溫孵育30分鐘。
注意:Streptavidin-HRP工作液的用量以完全覆蓋樣品為準(zhǔn)。孵育時(shí)需注意在多孔板的空隙中加水,或者對于切片宜使用濕盒(例如載玻片染色盒FSR958)來保持濕潤,以盡量減少Streptavidin-HRP工作液的蒸發(fā)。
b. 用洗滌液洗滌3次,每次2分鐘。
c. 滴加0.2-0.4ml DAB顯色液,室溫孵育5-30分鐘。
注:如果顯色很強(qiáng)可以短于5分鐘即停止顯色,如果顯色很弱,可以適當(dāng)延長顯色時(shí)間,甚至顯色過夜。
d. 用洗滌液洗滌3次,即可終止顯色反應(yīng)。如有必要可以使用適當(dāng)?shù)娜旧哼M(jìn)行復(fù)染,如伊紅染色液C0109、甲基綠染色液C0115、蘇木素染色液C0107、DAPI染色液C1005等。普通光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。