pShuttle-CMV-C-FLag是自行研發(fā)的用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)C端FLag tag(FLag標(biāo)簽)融合蛋白的重組腺病毒包裝用的穿梭質(zhì)粒。本穿梭質(zhì)粒構(gòu)建后，需要和預(yù)轉(zhuǎn)染了pAdEasy-1質(zhì)粒的BJ5183菌株(D8107)以及重組腺病毒包裝細(xì)胞配合使用才能完成重組腺病毒的包裝。
pShuttle-CMV-C-FLag含有CMV啟動(dòng)子可以高效啟動(dòng)目的蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)；在多克隆位點(diǎn)的3'端含有一個(gè)可以編碼Flag標(biāo)簽的序列，因此可以表達(dá)出含有Flag標(biāo)簽的融合蛋白，可以方便地使用抗Flag的抗體來識(shí)別目的蛋白，有利于目的蛋白檢測(cè)和分離純化。
本質(zhì)粒為卡那霉素抗性。
重組腺病毒(Recombinant adenoviruses)是一種常見的用于在培養(yǎng)細(xì)胞或動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)外源基因的重要工具。重組腺病毒具有感染宿主細(xì)胞范圍廣、感染不依賴細(xì)胞分裂、高滴度及目的基因表達(dá)水平高等特性。最常用的腺病毒載體是人類血清5型腺病毒。改造后的人類血清5型腺病毒，刪除了在病毒裝配過程中起關(guān)鍵作用的E1基因和非必須的能表達(dá)逃避宿主免疫的E3基因，E1和E3基因的刪除使得重組腺病毒不能自我復(fù)制，同時(shí)給外源基因的插入提供了空間，最長(zhǎng)可插入7.5kb的外源基因。從而提高了重組腺病毒的的安全性和可操作性。再利用攜帶E1基因的AD-293、293A、HEK293等細(xì)胞作為包裝細(xì)胞就可以完成重組腺病毒的包裝。
pShuttle系列的穿梭質(zhì)粒攜帶外源目的基因，經(jīng)過Pme I線性化，隨后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1(D8106)共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BJ5183中，或者轉(zhuǎn)化到已經(jīng)預(yù)轉(zhuǎn)化了pAdEasy-1質(zhì)粒的BJ5183菌株(D8107)中同源重組。BJ5183菌株表達(dá)recET基因，具有很高的基因同源重組(homologous recombination)活性，使帶有目的基因的穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1通過末端反向重復(fù)序列同源重組，實(shí)現(xiàn)外源基因與腺病毒基因組的整合。將重組的攜帶外源基因的腺病毒質(zhì)粒用Pac I線性化后轉(zhuǎn)染到AD-293、293A、HEK293等重組腺病毒包裝細(xì)胞中進(jìn)行包裝。從而制備獲得高滴度、自我復(fù)制缺陷并且?guī)в心康幕虻闹亟M腺病毒。
目的基因引入時(shí)不能含有Pme I及Pac I這兩個(gè)酶切位點(diǎn)，如果含有該兩個(gè)酶切位點(diǎn)的目的基因，需要對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行突變方可進(jìn)行基因操作。
pShuttle-CMV-C-FLag質(zhì)粒的主要信息如下：
| Feature Nucleotide | Position |
| left inverted terminal repeat | 1–103 |
| encapsidation signal (ES) | 183–331 |
| CMV promoter | 341–933 |
| multiple cloning site | 940–994 |
| FLag tag | 999-1025 |
| SV40 polyA | 1045–1251 |
| Ad5 right arm homology | 1256–3510 |
| Ad5 left arm homology | 3558–4441 |
| right inverted terminal repeat | 4442–4544 |
| pBR322 origin | 4752–5419 |
| kanamycin resistance ORF | 6228–7019 |
pShuttle-CMV-C-Flag質(zhì)粒的圖譜如下：
pShuttle-CMV-C-FLag質(zhì)粒的詳細(xì)圖譜見說明書：https://www.beyotime.com/Manual/D8119 pShuttle-CMV-C-FLag.pdf。
pShuttle-CMV-C-FLag中沒有的酶切位點(diǎn)(Restriction enzymes that do not cut pShuttle-CMV-C-FLag)包括：
| Acc65 I | Afl II | Age I | Asc I | Asp718 |
| Blp I | BsiC I | BsiW I | BstB I | Bsu36 I |
| Cla I | Eco72 I | EcoN I | Esp I | Fse I |
| Kpn I | Nru I | Pml I | Pvu I | Sfi I |
pShuttle-CMV-C-FLag中的單酶切位點(diǎn)(Restriction enzymes that cut pShuttle-CMV-C-FLag once)包括：
| BsrG I | T`GTAC,A | 193 | Hpa I | GTT|AAC | 1155 |
| SnaB | ITAC|GTA | 679 | PflM I | CCAN,NNN`NTGG | 1933 |
| Nhe I | G`CTAG,C | 940 | BstX I | CCAN,NNNN`NTGG | 2372 |
| Not I | GC`GGCC,GC | 945 | Bbs I | GAAGAC 8/12 | 3174 |
| BamH I | G`GATC,C | 952 | Bbv II | GAAGAC 7/11 | 3175 |
| Hind III | A`AGCT,T | 958 | Bst1107 I | GTA|TAC | 3528 |
| EcoR V | GAT|ATC | 966 | Xca I | GTA|TAC | 3528 |
| Sal I | G`TCGA,C | 970 | Pme I | CTTT|AAAC | 3549 |
| Mlu I | A`CGCG,T | 976 | EcoR I | G`AATT,C | 3554 |
| Bgl II | A`GATC,T | 982 | Avr II | C`CTAG,G | 4096 |
| PaeR7 I | C`TCGA,G | 988 | BspH I | T`CATG,A | 5492 |
| Xho I | C`TCGA,G | 988 | Psp1406 I | AA`CG,TT | 5891 |
| Xba I | T`CTAG,A | 994 | Rsr II | CG`GWC,CG | 6897 |
| Spe I | A`CTAG,T | 1033 | Dra III | CAC,NNN`GTG | 7244 |
| Sca I | AGT|ACT | 1038 | Xmn I | GAANN|NNTTC | 7498 |
pShuttle-CMV-C-FLag質(zhì)粒中推薦使用的測(cè)序引物序列如下：
forward primer (888-907): 5´GGTCTATATAAGCAGAGCTG3´
Reverse primer (1047-1069): 5´GTGGTATGGCTGATTATGATCAG 3´
pShuttle-CMV-C-FLag 的全序列信息:pShuttle-CMV-C-FLag.txt。
包裝清單：
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| D8119-1µg | pShuttle-CMV-C-Flag | 1μg |
| D8119-100µg | pShuttle-CMV-C-Flag | 100μg |
| — | 說明書 | 1份 |
保存條件：
-20℃保存。
注意事項(xiàng)：
本質(zhì)粒未經(jīng)書面許可不得用于任何商業(yè)用途，也不得移交給訂貨人所在實(shí)驗(yàn)室外的任何個(gè)人或單位。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1.首次使用1µg包裝的本產(chǎn)品時(shí)，請(qǐng)先取少量本質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行質(zhì)粒小量、中量或大量抽提后再用于后續(xù)用途。抽提獲得的質(zhì)粒可以通過酶切電泳進(jìn)行鑒定，或通過測(cè)序進(jìn)行鑒定。
2.pShuttle-CMV-C-FLag質(zhì)粒在其多克隆位點(diǎn)適當(dāng)酶切后可以插入待表達(dá)的目的基因，插入目的基因時(shí)注意與FLag不能發(fā)生移碼突變。攜帶目的基因的質(zhì)粒經(jīng)過Pme I線性化，隨后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1(D8106)共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BJ5183中，或者轉(zhuǎn)化到已經(jīng)已經(jīng)預(yù)轉(zhuǎn)了pAdEasy-1質(zhì)粒的BJ5183菌株(D8107)中進(jìn)行同源重組。將重組的攜帶外源基因的腺病毒質(zhì)粒用Pac I線性化后轉(zhuǎn)染到AD-293、293A、HEK293等重組腺病毒包裝細(xì)胞中進(jìn)行包裝。從而制備得高滴度、自我復(fù)制缺陷并且?guī)в心康幕虻闹亟M腺病毒
