EB分子中的錠是由一個苯基和一個三環(huán)菲錠環(huán)構(gòu)成，苯基可以繞三環(huán)菲錠環(huán)旋轉(zhuǎn)，而三環(huán)菲錠環(huán)是一個整體，呈扁 平狀，十分類似于DNA結(jié)構(gòu)中的AT堿基配對，故能以與DNA螺旋軸線垂直的方式嵌入到DNA堿基對之間。其結(jié)合力是范德華力和堿基相堆積力，其外圍的苯基和乙基基團還能扣在DNA的大溝上，使結(jié)合更加穩(wěn)定。插入DNA后錠與水脫離，而水是熒光淬滅劑，所以在DNA中錠的熒光強度恢復，熒光產(chǎn)率比溶液中游離錠的熒光產(chǎn)率高20-30倍。EB的熒光 需要波長為254 nm、302 nm或366 nm的激發(fā)光激發(fā)，但作用原理各不相同。254 nm的紫外輻射能量是先由DNA吸收（核酸在260 nm左右的光吸收特性）再將其傳遞給EB分子，302 nm和366 nm的紫外輻射能量是靠EB分子自身吸收。EB分子所得到能量在590 nm的橙紅色光譜區(qū)以0.3的量子產(chǎn)率重新發(fā)射出來，所以DNA-EB復合物呈紅色。由于254 nm紫外光對DNA的損傷較強，而在366 nm紫外光下EB產(chǎn)生的熒光又較弱，所以人們一般使用302 nm的紫外光來觀察EB染色后的核酸。
EB與DNA的結(jié)合幾乎沒有堿基序列特異性，在高離子強度的飽和溶液中，大約每2.5個堿基插入一個EB分子，此時 的DNA長度將增加27%。EB還可以結(jié)合到單鏈DNA或RNA分子內(nèi)形成的較短的鏈內(nèi)螺旋上，所以也可以檢測單鏈DNA 或RNA，但是EB對單鏈核酸的親和力相對較小，靈敏度較低。在凝膠中有EB存在的情況下，DNA的電泳遷移率會降低15%左右。
