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植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)測(cè)定試劑盒

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 產(chǎn)品組成:

組分貨號(hào)

名稱

規(guī)格

貯存

運(yùn)輸

RTU4062-01

試劑1-PEPCase提取緩沖液(2×)

100 ml

短期4,長(zhǎng)期-20

常溫

RTU4062-02

試劑2-PEPCase Assay buffer(10×)

15 ml

短期4,長(zhǎng)期-20

常溫

RTU4062-03

試劑3-PEP100×)

1 ml

-20℃

常溫

RTU4062-04

試劑4-NADH100×)

1.2 ml

-20

常溫

RTU4062-05

試劑5-MDH100×)  

2 KU

-20℃

常溫

RTU4062-06

試劑6-酶溶解緩沖液 

5 ml

-20

常溫

BSA-02

試劑7-BSA溶液 50mg/ml

5 ml

-20

常溫

DT0140P

試劑8-1MDTT100×)

1 ml

-20

常溫

DE005

試劑9-滅菌水

100 ml

4

常溫

●     產(chǎn)品簡(jiǎn)介:

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (Phosphoenolpyruvate  carboxylase,  PEPCase)是 C4 植物和CAM 植物固定CO2的關(guān)鍵酶,催化磷酸烯醇式丙酮酸與二氧化碳反應(yīng)生成草酰乙酸,在植物和細(xì)菌中廣泛存在,在動(dòng)物及絲狀霉菌中缺乏此酶。此酶是變構(gòu)酶,主要功能為三羧酸循環(huán)提供草酰乙酸, 另外也與 C4 植物光合二氧化碳固定反應(yīng)及景天科植物的蘋(píng)果酸形成 (景天酸代謝 )等有關(guān)。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PEPCase)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)原理如下:在弱堿條件下,PEPCase 催化 磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和CO2形成草酰乙酸(OAA);OAA 在蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)催化下被 NADH 還原為蘋(píng)果酸 (Mal) 。在堿性條件下每吸收 1 分子 CO2伴隨 1 分子 NADH 氧化,通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定處吸光度的變化,計(jì)算出 NADH 的消耗速率,進(jìn)一步推算出磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性水平。

該試劑盒主要用于檢測(cè)植物樣本中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域,不宜用于臨床診斷或其他用途。

按照一次使用1 ml 提取緩沖液計(jì)算,試劑盒可以使用100次。

 自備材料:

植物材料;剪刀;液氮;研缽或其他研磨設(shè)備;1ml石英比色皿;紫外分光光度計(jì);制冰機(jī);低溫離心機(jī)

 操作步驟:

一、 即用型PEPCase提取緩沖液配制:

 

一個(gè)反應(yīng)配制體積

n個(gè)反應(yīng)配制體積

 

1 ml

n×1 ml

PEPCase提取緩沖液(

500 μl

n×500μl

滅菌水

470 μl

n×470 μl

1 M DTT100×

10 μl

n×10 μl

BSA溶液50mg/ml

20 μl

n×20μl

注:1. 即用型PEPCase提取緩沖液盡量現(xiàn)配現(xiàn)用,短期4中可以過(guò)夜保存。

、 PEPCase樣品提取:

1. 取新鮮植物組織,清洗干凈,擦干,液氮中研磨,1 cm2葉片(1分硬幣大。┗0.1g葉片粉末加入1 ml 即用型PEPCase提取緩沖液,顛倒混勻,冰浴放置5-10分鐘。

2.12000g4℃離心 5分鐘,上清即為PEPCase提取液,冰浴放置備用。

注:提取液最好立即測(cè)定,不建議保存。

PEPCase活性測(cè)定分析

1. 即用型酶溶解緩沖液配制:

       按照標(biāo)簽所示,在試劑6-酶溶解緩沖液原瓶中加入1.5 ml滅菌水和1 ml BSA溶液(50mg/ml),混勻后即配成即用型酶溶解緩沖液,冰浴備用,-20℃保存。

2. 試劑3-PEP:按照標(biāo)簽所示加入滅菌水,徹底混勻后冰浴備用。

3. 試劑4-NADH:按照標(biāo)簽所示加入滅菌水,徹底混勻后冰浴備用。

注:NADH穩(wěn)定性較差,用后-20℃貯存3-4天,長(zhǎng)期-80℃保存。

4. 試劑5-MDH:按照標(biāo)簽所示加入即用型酶溶解緩沖液,徹底混勻后冰浴備用。

5. 反應(yīng)體系設(shè)定:

加入順序

組份

1ml反應(yīng)體系加入量

(測(cè)定1個(gè)樣品)

MasterMix配制

(測(cè)定n個(gè)樣品為例)

1

10×PEPCase Assay Buffer

100 μl

n×100 μl

2

滅菌水

 870 μl

n×870 μl

3

NADH溶液(100×

10 μl

n×10μl

4

PEP溶液(100×

10 μl

n×10 μl

5

MDH溶液(100×

10 μl

n×10 μl

5. 反應(yīng)體系測(cè)定;

1.5 ml離心管中配制以下反應(yīng)

 

1

2

 

對(duì)照反應(yīng)

樣品活性測(cè)定

MasterMix

975 μl

975 μl

即用型PEPCase提取緩沖液(步驟一)

25 μl

-

PEPCase樣品提取液

(步驟二)

-

25μl

 

 

混勻后加入到1 ml比色皿中,立即計(jì)時(shí),此時(shí)吸光度為A0,每隔 10s 測(cè)定一次吸光度,其中至 1min 時(shí)處吸光度記為 A1,記錄其變化。

注意: = 1 \* GB3  一般分光光度計(jì)OD340讀數(shù)在0.5-3之間數(shù)據(jù)比較準(zhǔn)確,低于此范圍說(shuō)明提取用的材料太少,酶活性太低;高于此范圍說(shuō)明所用材料太多,酶活性太高,此時(shí)可以將PEPCase樣品提取液用即用型PEPCase提取緩沖液稀釋后測(cè)定。

= 2 \* GB3  該反應(yīng)系統(tǒng)是利用速率變化,求得相應(yīng) OD 的變化,進(jìn)而推算出 NADH 的消耗速率,再進(jìn)一步推算出磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的量。 因此加入PEPCase樣品提取液后立即計(jì)時(shí)很重要,每次檢測(cè)指標(biāo)不宜過(guò)多,否則有可能由于操作時(shí)間有差異進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)果偏差。

、PEPCase活性計(jì)算:

根據(jù)如下公式計(jì)算樣品中PEPCase活性:

1. 根據(jù)葉片面積的計(jì)算公式:

Activity(μmol·m-2·S-1)==

Activity(μmol·m-2·S-1)-表示每秒每平方米葉片有多少μmol NADH被氧化

△A-反應(yīng)最初1分鐘內(nèi)340nm處測(cè)定管吸光度變化的絕對(duì)值,△A=A0-A1

N-稀釋倍數(shù),本程序中為40(1 ml提取液,取25μl測(cè)定)。

6.22-每微摩爾NADH在340nm處的吸光系數(shù)

d-cm 比色皿光程,一般為1  △t-秒 測(cè)定時(shí)間,本程序?yàn)?0秒  S-cm2 提取時(shí)使用的葉面積

2. 根據(jù)葉片鮮重的計(jì)算公式:

Activity(μmol·g-1·S-1)=

Activity(μmol·g-1·S-1)-表示每秒每克鮮重葉片有多少μmol NADH被氧化

△A-反應(yīng)最初1分鐘內(nèi)340nm處測(cè)定管吸光度變化的絕對(duì)值,△A=A0-A1

N-稀釋倍數(shù),本程序中為40(1 ml提取液,取25μl測(cè)定)。

6.22-每微摩爾NADH在340nm處的吸光系數(shù)

d-cm 比色皿光程,一般為1

△t-秒 測(cè)定時(shí)間,本程序?yàn)?0秒

g- 提取時(shí)使用的葉片鮮重

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