發(fā)光法支原體檢測(cè)試劑盒(低靈敏度儀器用) (Luminescent Mycoplasma Detection Kit for Low Sensitivity Instrument)，簡(jiǎn)稱或MycoLumi™，是一種通過(guò)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)培養(yǎng)的細(xì)胞等生物材料中是否有支原體污染的試劑盒。

發(fā)光法支原體檢測(cè)試劑盒(低靈敏度儀器用) (C0297)的用途與的同類(lèi)產(chǎn)品發(fā)光法支原體檢測(cè)試劑盒(高靈敏度儀器用) (C0298)相同，性能略有不同，具體請(qǐng)參考下表。兩種產(chǎn)品根據(jù)使用儀器的靈敏度對(duì)發(fā)光法支原體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行了一定的改良，使檢測(cè)試劑盒更適合相應(yīng)的檢測(cè)儀器。在相同檢測(cè)儀器條件下，發(fā)光法支原體檢測(cè)試劑盒(低靈敏度儀器用) (C0297)的讀值更高，一般為發(fā)光法支原體檢測(cè)試劑盒(高靈敏度儀器用) (C0298)的10-50倍，所以發(fā)光法支原體檢測(cè)試劑盒(低靈敏度儀器用) (C0297)更適合于低靈敏度、相對(duì)低讀值的化學(xué)發(fā)光儀，例如Molecular Devices的SpectraMax® M3等儀器，該類(lèi)儀器的讀值較低，使用低靈敏度儀器專(zhuān)用的檢測(cè)試劑盒可確保檢測(cè)時(shí)可獲得良好的化學(xué)發(fā)光讀數(shù)。發(fā)光法支原體檢測(cè)試劑盒(低靈敏度儀器用) (C0297)也可用于高靈敏度的儀器，此時(shí)讀值比較高，但對(duì)支原體的檢測(cè)靈敏度略差一些，即陽(yáng)性樣品的比值會(huì)低一些。而發(fā)光法支原體檢測(cè)試劑盒(高靈敏度儀器用) (C0298)更適合于高靈敏度、相對(duì)高讀值的化學(xué)發(fā)光儀，例如ThermoFisher的多功能酶標(biāo)儀Varioskan Flash/Varioskan LUX等儀器，該類(lèi)儀器的讀值較高，使用高靈敏度儀器專(zhuān)用的檢測(cè)試劑盒可使對(duì)于支原體的檢測(cè)靈敏度更高。發(fā)光法支原體檢測(cè)試劑盒(高靈敏度儀器用) (C0298)與Lonza公司的MycoAlert™ Mycoplasma Detection Kit相似，而發(fā)光法支原體檢測(cè)試劑盒(低靈敏度儀器用) (C0297)與Lonza公司的MycoAlert™ PLUS Mycoplasma Detection Kit相似。發(fā)光法支原體檢測(cè)試劑盒(低靈敏度儀器用) (C0297)對(duì)支原體的檢測(cè)靈敏度略低于發(fā)光法支原體檢測(cè)試劑盒(高靈敏度儀器用) (C0298)，具體表現(xiàn)為陽(yáng)性樣品的比值會(huì)低一些，但仍可滿足常規(guī)的檢測(cè)需求。兩種試劑盒的比較和選擇請(qǐng)參考下表：

支原體(Mycoplasma)是最小、最簡(jiǎn)單的原核生物。支原體有如下特征：支原體無(wú)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，所以針對(duì)細(xì)胞壁的許多常見(jiàn)的抗生素，如青霉素或β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素對(duì)支原體無(wú)效；支原體大小介于細(xì)菌和病毒之間，約為0.2-0.8μm，所以部分支原體可通過(guò)0.22μm濾器，常規(guī)的過(guò)濾對(duì)支原體無(wú)效；很多支原體由于自身的生物合成能力有限而依靠宿主提供營(yíng)養(yǎng)，所以通常吸附或散落在細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。支原體的這些特征使細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中存在支原體污染的風(fēng)險(xiǎn)，細(xì)胞的支原體污染已經(jīng)成為一個(gè)世界性的普遍問(wèn)題。支原體污染可能會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞的狀態(tài)，使細(xì)胞的基因表達(dá)、代謝特征發(fā)生變化，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)減緩、分化和死亡異常，嚴(yán)重影響細(xì)胞功能。這些影響因素會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性、可重復(fù)性和一致性，因此支原體污染的檢測(cè)非常重要。

細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌、酵母或霉菌污染在光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)，但支原體污染在光學(xué)顯微鏡下通常不可見(jiàn)，必須通過(guò)特定的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)支原體污染的常用方法有支原體分離培養(yǎng)、ELISA、特殊的生化檢測(cè)、PCR檢測(cè)以及DNA熒光染色檢測(cè)等。上述檢測(cè)方法中，大多操作步驟相對(duì)比較煩瑣、靈敏性不高或所需時(shí)間較長(zhǎng)。

發(fā)光法支原體檢測(cè)試劑盒是利用支原體特有酶的活性并通過(guò)ATP依賴的螢光素酶催化的發(fā)光反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)比較檢測(cè)試劑加入前后ATP量的變化來(lái)確定樣品是否有支原體污染。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只有兩個(gè)步驟，僅需約15分鐘。第一步是在樣品中加入支原體檢測(cè)試劑A，5分鐘后進(jìn)行檢測(cè)，讀值為A，此時(shí)檢測(cè)的是樣品中原有ATP的量；第二步是加入支原體檢測(cè)試劑B，10分鐘后進(jìn)行檢測(cè)，讀值為B，此時(shí)如果樣品有支原體污染，其特有的酶可以將支原體檢測(cè)試劑B中的ADP轉(zhuǎn)換為ATP，此時(shí)檢測(cè)的就是原有的本底ATP量和由支原體特有酶催化新生成的ATP量的總和。通過(guò)計(jì)算讀值B與A的比值就可以判斷是否有支原體污染。如果比值大于1.2表示有支原體污染，比值越大說(shuō)明污染程度越高，如果比值小于0.9說(shuō)明沒(méi)有支原體污染，如果比值介于0.9和1.2之間，建議原細(xì)胞(包含原培養(yǎng)液)繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)之后再測(cè)試一次。本試劑盒檢測(cè)支原體的原理參考圖1。

圖1. 發(fā)光法支原體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)支原體的原理。細(xì)胞上清中如果含有支原體，加入支原體檢測(cè)試劑A后會(huì)裂解支原體，支原體中的內(nèi)容物釋放，釋放出的ATP以及細(xì)胞上清中的ATP會(huì)在螢光素酶催化下產(chǎn)生螢光信號(hào)；加入支原體檢測(cè)試劑B之后，支原體中特有的酶可以使ADP轉(zhuǎn)換成ATP，生成的ATP可以跟檢測(cè)試劑中的螢光素酶反應(yīng)，產(chǎn)生的螢光信號(hào)進(jìn)一步增加。

本試劑盒可快速、有效、高靈敏度地檢測(cè)支原體污染，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中可隨時(shí)取少量培養(yǎng)液上清監(jiān)測(cè)是否有支原體污染。

本試劑盒螢光信號(hào)穩(wěn)定性好，在加入支原體檢測(cè)試劑A后，螢光信號(hào)穩(wěn)定，在5分鐘時(shí)即可檢測(cè)；加入支原體檢測(cè)試劑B后，如果是無(wú)支原體污染樣品，原有螢光信號(hào)會(huì)有一定程度的下降，而如果是有支原體污染樣品，螢光信號(hào)會(huì)隨時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，10分鐘時(shí)即可檢測(cè)。

如果發(fā)現(xiàn)有支原體污染，建議更換無(wú)污染的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。如果有必要預(yù)防或去除支原體，可以使用專(zhuān)用的支原體預(yù)防或去除試劑。

本試劑盒包含一定量陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)更可靠、便捷。陽(yáng)性對(duì)照不含支原體，無(wú)支原體污染風(fēng)險(xiǎn)。建議每次檢測(cè)都設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照也可單獨(dú)訂購(gòu)(C0299 發(fā)光法支原體檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照)。

對(duì)于96孔板，推薦使用50μl細(xì)胞培養(yǎng)液或其它樣品，此時(shí)本試劑盒C0297S包裝可檢測(cè)20個(gè)樣品，C0297M包裝可檢測(cè)100個(gè)樣品。

包裝清單：

保存條件：

-20℃保存，一年有效；-80℃保存，兩年有效。支原體檢測(cè)試劑A (C0297S-1或C0297M-1)需避光保存。

注意事項(xiàng)：

對(duì)于首次使用本試劑盒，不確定儀器是低靈敏度或高靈敏度時(shí)，建議先訂購(gòu)C0298S，如果讀數(shù)超過(guò)1萬(wàn)，基本是高靈敏度儀器，后續(xù)可選擇C0297；或者同時(shí)訂購(gòu)C0297S和C0298S，進(jìn)行實(shí)際比較后確定后續(xù)的選擇。

發(fā)光法支原體檢測(cè)試劑盒(低靈敏度儀器用) (C0297)也可用于高靈敏度的儀器，此時(shí)讀值比較高，但對(duì)支原體的檢測(cè)靈敏度略差一些，不建議用于低靈敏度儀器，此時(shí)讀值可能會(huì)比較低，使檢測(cè)出來(lái)的數(shù)據(jù)無(wú)法反映真實(shí)的支原體污染情況。

支原體檢測(cè)試劑A中含有螢光素酶，反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致其逐漸失活。盡管經(jīng)測(cè)試反復(fù)凍融5次對(duì)于其檢測(cè)效果無(wú)顯著影響，為取得良好的使用效果，第一次解凍后可適當(dāng)分裝保存，但需注意分裝的容器不能有ATP污染。反復(fù)凍融過(guò)程中，可能會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)試劑中出現(xiàn)少量沉淀，此時(shí)宜平衡至室溫，并盡量溶解。如仍有殘留的不溶物，可以離心去除后使用，經(jīng)測(cè)試不會(huì)影響后續(xù)的檢測(cè)效果。

陽(yáng)性對(duì)照須避免反復(fù)凍融，可適當(dāng)分裝后保存。

檢測(cè)時(shí)強(qiáng)烈建議使用白色96孔板，如果使用普通透明的96孔板，相鄰孔之間可能會(huì)產(chǎn)生相互干擾。

當(dāng)檢測(cè)對(duì)象是細(xì)胞時(shí)，需正常培養(yǎng)細(xì)胞至少24小時(shí)以上，3-6天更佳，然后直接使用未經(jīng)胰酶消化的細(xì)胞培養(yǎng)液上清作為樣品；當(dāng)檢測(cè)對(duì)象是一些支原體含量極其微量的樣品時(shí)，如細(xì)胞培養(yǎng)用的血清、胰酶、抗生素、培養(yǎng)液，最好經(jīng)過(guò)2-3天的培養(yǎng)后再測(cè)試。培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短，很可能會(huì)導(dǎo)致本產(chǎn)品無(wú)法檢測(cè)出支原體污染。如果只能培養(yǎng)較短時(shí)間，建議嘗試用支原體PCR檢測(cè)試劑盒(C0301)或其它方法進(jìn)行檢測(cè)。

由于某些貼壁細(xì)胞培養(yǎng)液上清中有少量細(xì)胞或?qū)τ趹腋〖?xì)胞的培養(yǎng)液，室溫200×g離心5分鐘后取上清檢測(cè)，否則背景值會(huì)比較高。

檢測(cè)時(shí)請(qǐng)?jiān)谑覝?0-25℃左右進(jìn)行，否則會(huì)影響檢測(cè)效果。化學(xué)發(fā)光反應(yīng)和支原體特異性酶催化的反應(yīng)都受溫度影響，檢測(cè)試劑、檢測(cè)樣品都必須平衡至室溫才可以進(jìn)行檢測(cè)。

人體皮膚表面有豐富的ATP，檢測(cè)時(shí)請(qǐng)戴好手套，防止污染試劑。其它耗材也需潔凈、無(wú)污染。

本產(chǎn)品僅限于專(zhuān)業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說(shuō)明：
1.需要用戶自己準(zhǔn)備的器材：
a.化學(xué)發(fā)光儀(luminometer)或者具有檢測(cè)化學(xué)發(fā)光功能的酶標(biāo)儀、和酶標(biāo)儀配套使用的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)專(zhuān)用的96孔板(白板)。
b.無(wú)菌離心管、槍頭及移液槍。
2.試劑和檢測(cè)樣品準(zhǔn)備：
a.所有試劑使用前要平衡至室溫，最適宜的溫度是20-25℃。
b.檢測(cè)樣品準(zhǔn)備：取0.2-1ml培養(yǎng)3-6天的細(xì)胞上清(培養(yǎng)時(shí)間較短的細(xì)胞上清也可以檢測(cè)，但上清中釋放的支原體較少，檢測(cè)靈敏度會(huì)顯著下降)，200×g (約1500rpm)離心5分鐘以沉淀少量漂浮的細(xì)胞或細(xì)胞碎片，取上清。上清樣品最好收集后立即檢測(cè)，也可以在室溫或4℃放置并當(dāng)天檢測(cè)，或者置于-80℃保存半年內(nèi)檢測(cè)。低溫保存的樣品檢測(cè)的時(shí)候須室溫融化并達(dá)到室溫后才可用于檢測(cè)。
3.實(shí)驗(yàn)步驟：
a.在檢測(cè)板中加入50μl的檢測(cè)樣品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照(如無(wú)菌水或PBS、新鮮培養(yǎng)液)。
b.加入50μl的支原體檢測(cè)試劑A，混勻，20-25℃放置5分鐘。然后用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，即讀值為A。請(qǐng)根據(jù)儀器要求設(shè)置相應(yīng)的參數(shù)，每個(gè)孔的檢測(cè)時(shí)間一般為0.25-1秒或更長(zhǎng)時(shí)間，具體需根據(jù)儀器的檢測(cè)靈敏度進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。
c.加入50μl的支原體檢測(cè)試劑B，混勻，20-25℃放置10分鐘。然后用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，即讀值為B。注：請(qǐng)嚴(yán)格按照加入支原體檢測(cè)試劑B后10分鐘進(jìn)行檢測(cè)，切勿提前或延后，否則可能會(huì)影響比值在臨界值附近樣品的結(jié)果判斷。
d.計(jì)算比值(Ratio)=讀值B/讀值A(chǔ)。參考表1，比值大于1.2說(shuō)明有支原體污染，比值小于0.9表示沒(méi)有支原體污染，比值在0.9-1.2之間可以將原樣品繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)后重新檢測(cè)。
表1. 發(fā)光法支原體檢測(cè)試劑盒的結(jié)果分析。

備注1：有些樣品如添加了特殊藥物或使用某些特殊培養(yǎng)液，可能含有抑制或增強(qiáng)反應(yīng)的成分而導(dǎo)致假陰性或假陽(yáng)性，此時(shí)可以將樣品稀釋10倍后再進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)一步根據(jù)稀釋后測(cè)定出來(lái)的B/A比值來(lái)判定是否有支原體污染。
備注2：本試劑盒可以檢測(cè)出常見(jiàn)的44種支原體污染(具體見(jiàn)附錄)，但是不能具體區(qū)分是何種支原體污染。如需鑒定污染支原體種類(lèi)，請(qǐng)選用支原體PCR檢測(cè)試劑盒(C0301)。
e.本試劑盒用ThermoFisher的多功能酶標(biāo)儀Varioskan LUX檢測(cè)一些常見(jiàn)樣品的示例結(jié)果請(qǐng)參考表2。陽(yáng)性對(duì)照(Positive Control)為試劑盒中提供的陽(yáng)性對(duì)照，常用溶劑(Common Solvents)為超純水(Water)和PBS，常用細(xì)胞培養(yǎng)液(Common Culture Medium)為RPMI-1640和DMEM，陽(yáng)性樣品(Positive Samples)為支原體污染的HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清(其中10倍稀釋為按1:9用PBS稀釋)，陰性樣品(Negative Samples)為無(wú)支原體污染的BEAS-2B和293T細(xì)胞培養(yǎng)上清。本試劑盒提供的陽(yáng)性對(duì)照，由于反復(fù)凍融導(dǎo)致部分失活等因素，實(shí)際測(cè)定出來(lái)的比值可能會(huì)和表2和圖2中所列數(shù)據(jù)有較明顯的偏差。而超純水、PBS、RPMI-1640和DMEM檢測(cè)出來(lái)的比值數(shù)據(jù)和所列數(shù)據(jù)會(huì)相對(duì)比較接近。實(shí)際測(cè)定出來(lái)的讀值A(chǔ)和B，不同的儀器設(shè)備可能會(huì)有非常大的差別。
表2. 發(fā)光法支原體檢測(cè)試劑盒(低靈敏度儀器用)檢測(cè)數(shù)據(jù)示例。注：ThermoFisher的多功能酶標(biāo)儀Varioskan LUX為高靈敏度儀器，所以讀值較高，實(shí)際在低靈敏度儀器中，讀值可能在幾十至上千。

圖2. 發(fā)光法支原體檢測(cè)試劑盒(低靈敏度儀器用)檢測(cè)數(shù)據(jù)分析。實(shí)際讀數(shù)和比值會(huì)因細(xì)胞種類(lèi)、細(xì)胞培養(yǎng)液、檢測(cè)儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。