產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的方法有很多種，如磷酸鈣轉(zhuǎn)染法、 DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體法、電穿孔法、顯微注射法等。磷酸鈣法細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒(Calcium Phosphate Cell Transfection Kit)是在傳統(tǒng)的磷酸鈣細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良，提高了轉(zhuǎn)染效 率，并降低了毒性，可用于磷酸鈣法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，不僅可以瞬時(shí)表達(dá)，也可以篩選穩(wěn)定株。 HEK293 是最適合磷酸鈣法轉(zhuǎn)染的細(xì)胞之一，優(yōu)化條件后轉(zhuǎn)染效率可以高達(dá) 85%以上，一般的轉(zhuǎn)染效率可達(dá) 40～50%左右。其他常見細(xì)胞(例如 Hela、CHO 細(xì)胞等)也適合磷酸鈣法轉(zhuǎn)染，但效率比 293 細(xì)胞要略低一些。本轉(zhuǎn)染試劑盒主要適合于大多數(shù)貼壁細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，也可于一些懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，一般要求 DNA 濃度在 10～50μg 為宜，Hela、BALB 等細(xì)胞沉淀放置 16h，CHO、DUKX、BⅡ等細(xì)胞可以通過甘油、DMSO 進(jìn)行熱休克處理以提高轉(zhuǎn)染效率。
產(chǎn)品組成：
試劑(A): Calcium chloride solution
試劑(B): BBS solution
自備材料：
1、胰蛋白酶消化液
2、完全培養(yǎng)基
3、PBS
4、無菌水
操作步驟(僅供參考)：
(一)貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染：
1、在轉(zhuǎn)染前 24h 用胰蛋白酶消化培養(yǎng)細(xì)胞，取適量對(duì)數(shù)期細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)器皿中，待細(xì)胞密度達(dá) 70～80%即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。后續(xù)操作步驟均按 6 孔板計(jì)算，如果轉(zhuǎn)染器皿不同，請(qǐng)按比例自行調(diào)節(jié)用量。
2、在加入 DNA 之前 2～4h，加入 2ml 不含抗生素的完全培養(yǎng)液，置于 37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3、取 2～6μg DNA(體積不宜超過 20μl)加入 100μl Calcium chloride solution，混勻，
即為 DNA-CaCl2溶液。
4、取 BBS solution 100μl，用移液器一邊吹打 BBS solution，一邊逐滴加入 DNA-CaCl2 溶液(操作緩慢，一般在 1～2min)。
5、室溫靜置 20～30min，即為 DNA-CaCl2-BBS 溶液，此時(shí)可能出現(xiàn)極其微小顆粒沉淀。
6、取 DNA-CaCl2-BBS 溶液底部物質(zhì)均勻加入到 6 孔板細(xì)胞中，輕輕晃動(dòng)混勻。
7、置于 37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 4～16h。如果培養(yǎng)細(xì)胞為 CHO、DUKX 等，可以 DMSO 或甘油進(jìn)行休克處理，轉(zhuǎn)染效率會(huì)大大增加，即培養(yǎng) 4～6h 后，用 2ml 含 10%甘油或 20%DMSO 的完全培養(yǎng)液替換當(dāng)前培養(yǎng)液，室溫下靜置 3min，加 5ml PBS 搖動(dòng)混勻。
8、去除培養(yǎng)液，用 PBS 清洗細(xì)胞 2 次，加入 2ml 完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，一般 24h 后可見 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表達(dá)。
(二)懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染：
1、低速離心收集懸浮細(xì)胞，用 PBS 洗滌 1 次。
2、取 2～6μg DNA(體積不宜超過 20μl)加入 100μl Calcium chloride solution，混勻， 即為 DNA-CaCl2溶液。
3、取 BBS solution 100μl，用移液器一邊吹打 BBS solution，一邊逐滴加入 DNA-CaCl2 溶液(操作緩慢，一般在 1～2min)。
4、室溫靜置 20～30min，即為 DNA-CaCl2-BBS 溶液，此時(shí)可能出現(xiàn)極其微小顆粒沉淀。
5、每 10 個(gè)細(xì)胞沉淀用 100μl DNA-CaCl2-BBS 溶液重新懸浮，室溫放置 20～30min。
6、6 孔板6每孔加入 2ml 不含抗生素的完全培養(yǎng)基，取 DNA-CaCl2-BBS 溶液底部物質(zhì)均勻 加入到 6 孔板中，輕輕晃動(dòng)混勻。
7、置于 37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 4～16h，去除培養(yǎng)液，用 PBS 清洗細(xì)胞 2 次，加入 2ml 完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，一般 24h 后可見轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表達(dá)。
注意事項(xiàng)：
1、 注意無菌操作，盡量避免污染，同時(shí) DNA 不應(yīng)含有蛋白和酚。
2、 休克處理某些細(xì)胞系會(huì)使轉(zhuǎn)染效率大大提高，但應(yīng)注意甘油暴露過久易導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
3、 轉(zhuǎn)染 12～24h 后，可以加入終濃度為 10mmol/L 的丁酸鈉溶液，可以提高病毒滴度。
4、 BBS solution 的 pH 值直接關(guān)系到轉(zhuǎn)染效率，盡量避免長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中，以免被 空氣中的二氧化碳酸化。
有效期： 6 個(gè)月有效。
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