植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(Plant Protoplasts Transfection Kit)，可用于將質(zhì)粒、Cas9/sgRNA等蛋白和RNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入植物原生質(zhì)體內(nèi)，經(jīng)轉(zhuǎn)染的植物原生質(zhì)體經(jīng)過(guò)一定時(shí)間培養(yǎng)后，可用于檢測(cè)外源基因的表達(dá)和功能，或者轉(zhuǎn)染后的基因下調(diào)、基因敲除或基因編輯效果等。

對(duì)于擬南芥原生質(zhì)體，使用本試劑盒轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后通常2-6小時(shí)可以檢測(cè)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄變化(mRNA等RNA的變化)，通常2-16小時(shí)后可以檢測(cè)到相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，通常24小時(shí)可以檢測(cè)到基因編輯的效果。

植物原生質(zhì)體是開(kāi)展一系列植物細(xì)胞研究的重要材料，可以用于如將DNA、RNA或者蛋白通過(guò)電擊法(electroporation)、顯微注射(microinjection)或聚乙二醇法介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(PEG-mediated transfection)等。本試劑盒采用的是一種優(yōu)化的聚乙二醇轉(zhuǎn)染方法，借助聚乙二醇短時(shí)間內(nèi)對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)生的沖擊效應(yīng)，使質(zhì)粒DNA、RNA或蛋白得以進(jìn)入原生質(zhì)體，具有使用便捷、轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點(diǎn)。

本試劑盒可植物原生質(zhì)體分離試劑盒配合使用，完成一些模式生物如擬南芥原生質(zhì)體外源基因的短時(shí)間或長(zhǎng)期表達(dá)或者內(nèi)源基因的關(guān)閉、下調(diào)或編輯等。

使用本試劑盒將植物EGFP表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染擬南芥原生質(zhì)體的效果如圖1所示。圖中可見(jiàn)可以獲得非常高的轉(zhuǎn)染效率。

圖1. 使用植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(Plant Protoplasts Transfection Kit)轉(zhuǎn)染擬南芥原生質(zhì)體的效果圖。對(duì)于使用植物原生質(zhì)體分離試劑盒(C0362)獲得的擬南芥葉片原生質(zhì)體，參考如下體系制備轉(zhuǎn)染試劑溶液：稱取0.48g轉(zhuǎn)染試劑于2ml離心管(FCT121)中，加入300μl溶液A、480μl溶液B，顛倒混勻，使轉(zhuǎn)染試劑充分溶解后備用(足夠用于10個(gè)后續(xù)的10個(gè)樣品的轉(zhuǎn)染)。在2ml的圓底離心管(FTUB019)中加入20μg p35SPPDK-EGFP-Flag (植物用綠色熒光蛋白) (D2627)，加入100μl制備好的原生質(zhì)體，輕柔混勻后加入110μl當(dāng)日配制好的轉(zhuǎn)染試劑溶液，輕柔混勻，室溫靜置5min后加入440μl終止液，輕輕顛倒混勻，室溫100g離心1min，去除上清，再加入0.5ml終止液，輕柔重懸原生質(zhì)體，室溫100g離心1min后，盡量去除上清，收集原生質(zhì)體。加入1ml培養(yǎng)液，小心重懸原生質(zhì)體后將其平置25℃培養(yǎng)過(guò)夜(約16h)，次日于熒光顯微鏡下檢測(cè)EGFP熒光信號(hào)。上圖為實(shí)際檢測(cè)的明場(chǎng)和熒光照片。

一個(gè)小包裝(C0563S)的本試劑盒可以用于相當(dāng)于6孔板100個(gè)孔的樣品，12孔板200個(gè)孔的樣品，或24孔板400個(gè)孔的樣品的轉(zhuǎn)染。一個(gè)中包裝(C0563M)的本試劑盒可以用于相當(dāng)于6孔板500個(gè)孔的樣品，12孔板1000個(gè)孔的樣品，或24孔板2000個(gè)孔的樣品的轉(zhuǎn)染。

包裝清單：

保存條件：

-20℃保存，一年有效。轉(zhuǎn)染試劑可以室溫或4℃保存。1-2周內(nèi)多次使用可以4℃保存。

注意事項(xiàng)：

請(qǐng)按照試劑盒要求的保存條件存放相關(guān)試劑，使用時(shí)請(qǐng)將各溶液充分融解并混勻。

本試劑盒使用時(shí)，需要按照無(wú)菌操作要求規(guī)范進(jìn)行，避免微生物污染。培養(yǎng)液可適當(dāng)分裝后保存。

本產(chǎn)品僅限于專(zhuān)業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說(shuō)明：
1.轉(zhuǎn)染試劑溶液的配制。
對(duì)于原生質(zhì)體樣品(每個(gè)樣品為2萬(wàn)個(gè)原生質(zhì)體)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，參考下表根據(jù)樣品量配制轉(zhuǎn)染試劑溶液，配制后室溫存放備用。轉(zhuǎn)染試劑溶液需要在轉(zhuǎn)染前至少1小時(shí)配制，以確保轉(zhuǎn)染試劑溶解充分。轉(zhuǎn)染試劑溶液配制后盡量當(dāng)天使用。配制好的轉(zhuǎn)染試劑溶液室溫保存5天之內(nèi)仍然有較好的轉(zhuǎn)染效率，但和當(dāng)天配制的轉(zhuǎn)染試劑溶液相比，轉(zhuǎn)染效果可能會(huì)有一定程度的下降。

2.質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染：
a.取10μl質(zhì)粒DNA(10-20μg)于2ml圓底離心管中。質(zhì)粒大小建議為5~10kb，質(zhì)粒濃度為1~2μg/μl左右。
多個(gè)質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)的體積和總質(zhì)量保持不變。多個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時(shí)，每種質(zhì)粒的用量比例，需要酌情自行調(diào)整。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染也可以在12或24孔板中進(jìn)行，轉(zhuǎn)染體系也可以按照比例放大或縮小。本試劑盒中描述的用量相當(dāng)于是6孔板中的用量。原生質(zhì)體用多孔板培養(yǎng)時(shí)，最好選擇未經(jīng)表面處理的多孔板。對(duì)于經(jīng)過(guò)表面處理的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用多孔板，可以使用5%胎牛血清或小牛血清處理孔表面數(shù)秒，這樣有助于減小孔底表面對(duì)于原生質(zhì)體的損傷。
b.加入100μl濃度約為2×10⁵/ml的原生質(zhì)體懸浮液(共約2萬(wàn)個(gè)原生質(zhì)體)，輕輕混勻。
c.加入110μl至少提前1小時(shí)配制好的轉(zhuǎn)染試劑溶液，輕輕彈擊離心管底部，以充分混勻。
d.25℃靜置孵育5min。最長(zhǎng)可以孵育15min，但通常孵育5min時(shí)間已經(jīng)足夠。最佳的孵育時(shí)間對(duì)于不同的原生質(zhì)體和不同的質(zhì)粒需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索。
e.加入440μl的終止液，輕輕混勻，25℃ 100g離心1-2min，盡量去除上清，收集原生質(zhì)體。由于轉(zhuǎn)染液非常粘稠，本步驟加入終止液后離心1min通常可以使原生質(zhì)體聚集在管底，但使用某些突變體時(shí)為減少原生質(zhì)體損失，可將離心時(shí)間延長(zhǎng)至2min。
f.加入500μl終止液輕輕重懸原生質(zhì)體，25℃ 100g離心1min后去除上清，盡量去除殘留的上清。本步驟可以充分去除殘留的轉(zhuǎn)染試劑溶液中的組分，避免轉(zhuǎn)染試劑溶液中的組分對(duì)于后續(xù)的不良影響。
g.加入1ml培養(yǎng)液，小心重懸原生質(zhì)體，隨后將離心管平置，23-25℃弱光培養(yǎng)。
h.根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，可以在轉(zhuǎn)染后2-6小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間，檢測(cè)相關(guān)的RNA，可以在轉(zhuǎn)染后2-16小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間，檢測(cè)相關(guān)的蛋白或酶活性。基因編輯的效果在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后就可能被檢測(cè)到。
3.Cas9/sgRNA等蛋白和RNA的轉(zhuǎn)染。
a.取200μl濃度約為1×10⁶/ml的原生質(zhì)體(共約20萬(wàn)原生質(zhì)體)懸浮溶液加至1.5ml離心管，加入3.3μl或10μl Cas9 (6μg/μl)和sgRNA (2.2μg/μl for each sgRNA)，輕輕混勻，加入200μl提前配制好的轉(zhuǎn)染試劑溶液，輕輕混勻，25℃靜置孵育5-20min。其它蛋白或RNA的轉(zhuǎn)染可以參考進(jìn)行。最佳的孵育時(shí)間需要根據(jù)特定的實(shí)驗(yàn)條件適當(dāng)摸索。
b.加入800μl終止液，輕輕混勻，25℃ 100g離心5min，盡量去除上清，收集原生質(zhì)體。
c.加入1ml終止液，輕輕重懸原生質(zhì)體，25℃條件下100g離心2min后，盡量去除上清。
d.用1ml培養(yǎng)液輕輕重懸原生質(zhì)體，將其平置23-25℃培養(yǎng)過(guò)夜(16-24h)。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后就很可能檢測(cè)到基因編輯產(chǎn)生的插入或缺失突變(Indel)。采用其它適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液對(duì)于基因編輯的效果可能更好，例如Modified KM 8p liquid medium with 400 mM glucose等。
常見(jiàn)問(wèn)題：
1.轉(zhuǎn)染效率低。
a.轉(zhuǎn)染試劑溶液的質(zhì)量對(duì)于轉(zhuǎn)染效率的影響較大。轉(zhuǎn)染試劑溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，不能高溫高壓滅菌，并且需要確保轉(zhuǎn)染試劑充分溶解。
b.原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染對(duì)于質(zhì)粒的純度要求較高，需要盡量使用高純度的質(zhì)粒。
c.由于質(zhì)粒的大小會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)染效率產(chǎn)生影響，可通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索轉(zhuǎn)染時(shí)不同大小質(zhì)粒的用量與原生質(zhì)體的比例。
d.原生質(zhì)體質(zhì)量對(duì)轉(zhuǎn)染效果影響很大，建議使用生長(zhǎng)健康的植物如擬南芥的嫩綠葉片進(jìn)行原生質(zhì)體分離。通常原生質(zhì)體如果在轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)的過(guò)程中發(fā)生破碎的現(xiàn)象，會(huì)嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)染效果。原生質(zhì)體發(fā)生破碎和制備原生質(zhì)體的樣品生長(zhǎng)狀態(tài)欠佳、制備步驟出現(xiàn)問(wèn)題或后續(xù)轉(zhuǎn)染時(shí)操作不當(dāng)(例如和轉(zhuǎn)染試劑溶液孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等)有關(guān)。