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丙酮酸(pyruvic acid PA)含量檢測(cè)試劑盒

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上海細(xì)胞庫(kù)丙酮酸(pyruvic acid PA)含量檢測(cè)試劑盒

<  微量法 100管/96樣>

 

   意:正式測(cè)定前務(wù)必取 3 - 5 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義:

丙酮酸通過(guò)乙酰CoA連接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代謝,起著重要的樞紐作用。

測(cè)定原理:

丙酮酸與2,4-二硝基苯肼作用,生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙,在堿性溶液中呈色。

自備的儀器和用品:

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、蒸餾水。

試劑的組成和配制:

提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存;

試劑一:液體2.5mL×1瓶, 4℃避光保存;

試劑二:液體12.5mL×1瓶, 4℃保存。

上海細(xì)胞庫(kù)丙酮酸(pyruvic acid PA)含量檢測(cè)試劑盒

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎(冰浴,功率20%200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次),靜置30min, 8000g,25離心10min,取上清待測(cè)。 

2、組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿,靜置30min,8000g,25離心10min,取上清待測(cè)。 

3、血清(漿)樣品:按照血清(漿)體積(mL:提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議0.1mL血清(漿)加入1mL提取液,進(jìn)行冰浴勻漿,靜置30min, 8000g,25離心10min,取上清待測(cè)。
測(cè)定步驟:

1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至520nm,蒸餾水調(diào)零。

2、在微量石英比色皿或96孔板中加入75μL樣本和25μL試劑一,混勻,靜置2min,加入125μL試劑二,混勻,于520nm波長(zhǎng)處測(cè)定管吸光值A(chǔ)。

丙酮酸含量計(jì)算:

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y = 0.0466x + 0.0675;

x為丙酮酸含量(µg/mL),y為吸光值。

2、按照血清(漿)體積計(jì)算

丙酮酸含量(μg/mL)= [(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷V3×V1÷V2)

=214.6×(A-0.0675)

3、按照蛋白濃度計(jì)算

丙酮酸含量(μg/mg prot=[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(V1×Cpr)

=21.46×(A-0.0675) ÷Cpr

4、按照樣品質(zhì)量計(jì)算

丙酮酸含量(µg/g鮮重)= [(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(W ×V1÷V2)

=21.46×(A-0.0675) ÷W

5、按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

丙酮酸含量(μg/104 cell)=[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷500×V1÷V2)

=0.043×(A-0.0675)

V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.075mL;V2:加入提取液體積,1 mL;V3:加入血清(漿)體積0.1 mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬(wàn)。

b. 96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y = 0.0233x + 0.0675;

x為丙酮酸含量(µg/mL),y為吸光值。

2、按照血清(漿)體積計(jì)算

丙酮酸含量(μg/mL)= [(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷V3×V1÷V2)

=429.2×(A-0.0675)

3、按照蛋白濃度計(jì)算

丙酮酸含量(μg/mg prot=[(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷(V1×Cpr)

=42.92×(A-0.0675) ÷Cpr

4、按照樣品質(zhì)量計(jì)算

丙酮酸含量(µg/g鮮重)= [(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷(W ×V1÷V2)

=42.92×(A-0.0675) ÷W

5、按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

丙酮酸含量(μg/104 cell)=[(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷500×V1÷V2)

=0.086×(A-0.0675)

V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.075mL;V2:加入提取液體積,1 mL;V3:加入血清(漿)體積,0.1 mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬(wàn)。

 

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