測(cè)定意義:
LDH(EC 1.1.1.27)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,是糖酵解途徑的末端酶,催化丙酮酸與乳酸之間的可逆反應(yīng),伴隨著NAD+/NADH之間互變。
測(cè)定原理:
LDH催化NAD+氧化乳酸生成丙酮酸,丙酮酸進(jìn)一步與2, 4 - 二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙,在堿性溶液中顯棕紅色,顏色深淺與丙酮酸濃度成正比。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
提取液:60mL×1瓶, 4℃保存;
試劑一:液體5 mL×1瓶, 4℃保存;
試劑二:粉劑×1支,-20℃保存,用時(shí)加入10μL試劑五和1.3 mL蒸餾水充分溶解備用,用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融;
試劑三:液體5 mL×1瓶,4℃保存;
試劑四:液體20 mL×1瓶,4℃保存;
試劑五:液體100μL×1支,4℃保存;
樣品測(cè)定的準(zhǔn)備:
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為1000~5000:1的比例(建議2000萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
2、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。
測(cè)定步驟:
1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至450nm,蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測(cè)定(在EP管中加入下列試劑)
試劑名稱(μL) | 測(cè)定管 | 對(duì)照管 |
樣本 | 10 | 10 |
試劑一 | 50 | 50 |
試劑二 | 10 |
|
蒸餾水 |
| 10 |
充分混勻,37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)準(zhǔn)確水浴15min
試劑三 | 50 | 50 |
充分混勻,37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)準(zhǔn)確水浴15min
試劑四 | 150 | 150 |
充分混勻,室溫靜置15min, 450 nm下測(cè)定吸光度,計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管。
LDH活力單位的計(jì)算:
a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸曲線, y = 0.9108x+0.0037 (x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度,umol/mL;y為ΔA)。
2、血清(漿)LDH活力的計(jì)算
單位的定義:每mL血清(漿)每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。
LDH(nmol/min/mL)=(ΔA-0.0037)÷0.9108÷T×103=73.2×ΔA
3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中LDH活力的計(jì)算
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。
LDH(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0037)÷0.9108×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =73.2×ΔA÷Cpr
需要另外測(cè)定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。
(2) 按樣本鮮重計(jì)算:
單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。
LDH(nmol/min/g鮮重)=[(ΔA-0.0037)÷0.9108×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103 =73.2×ΔA÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
單位的定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。
LDH(nmol/min/104 cell)= [(ΔA-0.0037)÷0.9108×V1]÷(2000×V1÷V2)÷T×103 =0.037×ΔA
V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.01mL;V2:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,15 min;Cpr:蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;2000:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),2000萬(wàn);103:1umol/mL=103 nmol/mL。
b. 使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下:
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸曲線, y = 0.4554x+0.0037 (x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度,umol/mL;y為ΔA)。
2、血清(漿)LDH活力的計(jì)算
單位的定義:每mL血清(漿)每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。
LDH(nmol/min/mL)=(ΔA-0.0037)÷0.4554÷T×103=146.4×(ΔA-0.0037)
3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中LDH活力的計(jì)算
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。
LDH(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0037)÷0.4554×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =146.4×(ΔA-0.0037)÷Cpr
需要另外測(cè)定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。
(2) 按樣本鮮重計(jì)算:
單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。
LDH(nmol/min/g鮮重)=[(ΔA-0.0037)÷0.4554×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103 =146.4×(ΔA-0.0037)÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
單位的定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。
LDH(nmol/min/104 cell)= [(ΔA-0.0037)÷0.4554×V1]÷(2000×V1÷V2)÷T×103 =0.073×(ΔA-0.0037)
V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.01mL;V2:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,15 min;Cpr:蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;2000:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),2000萬(wàn);103:1umol/mL=103 nmol/mL。
1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為:0.1 umol/mL -2 umol/mL。
2、 ΔA線性范圍為:0.01 -1。