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堿性磷酸酶(AKP/ALP)試劑盒

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注意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義:                           

AKP/ALP是一種含鋅的糖蛋白酶,在堿性環(huán)境中可水解各種天然及人工合成的磷脂單酯化合物。AKP/ALP廣泛分布于人體各臟器中,以肝臟為主。

 

測(cè)定原理:

在堿性環(huán)境中,AKP/ALP催化磷酸苯二鈉生成游離酚;酚與4-氨基安替比林和鐵氰化鉀反應(yīng)紅色亞醌衍生物,在510nm有特征光吸收;通過(guò)測(cè)定510 nm吸光度增加速率,來(lái)計(jì)算AKP活性。

 

自備儀器和用品

可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

試劑一:液體×1瓶,4℃保存。

試劑二:液體×1瓶,4℃避光保存。

試劑三:液體×1瓶,4℃避光保存。

試劑四:液體×1瓶,4℃避光保存,未變成藍(lán)綠色之前均可使用。

標(biāo)準(zhǔn)品:液體×1支(EP管中),2 μ mol/mL酚標(biāo)準(zhǔn)液,4℃保存。

 

粗酶液提。

1. 組織:按照組織質(zhì)量(g試劑一(mL)15~10的比例(建議稱(chēng)取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿,4℃、8000g離心10min,取上清液待測(cè)。

2. 細(xì)菌或細(xì)胞:按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);然后8000g,4,離心10min,取上清置于冰上待測(cè)。

3. 血液可直接測(cè)定,或者適當(dāng)稀釋后測(cè)定。

 

測(cè)定步驟:

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到510 nm,蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑三置于37℃水浴中預(yù)熱30 min。

3. 空白管:取EP管,加入20μL蒸餾水,200μL試劑二,200μL試劑三,混勻后置于37℃水浴中保溫15min;加入試劑四600μL,混勻后于510 nm測(cè)定吸光度,記為A空白管。

4. 標(biāo)準(zhǔn)管:取EP管,加入20μL標(biāo)準(zhǔn)品,200μL試劑二,200μL試劑三,混勻后置于37℃水浴中保溫15min;加入試劑四600μL,混勻后于510 nm測(cè)定吸光度,記為A標(biāo)準(zhǔn)管。

5.對(duì)照管:取EP管,加入20μL上清液,200μL蒸餾水200μL試劑三,混勻后置于37℃水浴中保溫15min;加入試劑四600μL,混勻后于510 nm測(cè)定吸光度,記為A測(cè)定管。

 

6. 測(cè)定管:取EP管,加入20μL上清液,200μL試劑二,200μL試劑三,混勻后置于37℃水浴中保溫15min;加入試劑四600μL,混勻后于510 nm測(cè)定吸光度,記為A測(cè)定管。

注意:空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)定一次。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

 

AKP/ALP活性計(jì)算:

1. 血液中AKP/ALP活力計(jì)算

活性單位定義:37中每毫升血液每分鐘催化產(chǎn)生1μmol酚定義為1個(gè)酶活單位。

AKP/ALP活力(μmol/min /mL)= [C標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V反總] ÷V÷T=6.8×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)

2. 組織、細(xì)菌或細(xì)胞AKP/ALP活性計(jì)算

1)按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義:37中每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 μ mol酚定義為1個(gè)酶活單位。

AKP/ALP(μmol/min/mg prot)=[C標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V反總]÷(Cpr×V)÷T=6.8×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管) ÷Cpr

2)按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義:37中每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1 μ mol酚定義為1個(gè)酶活單位。

AKP/ALP(μmol/min/g 鮮重)=[C標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V反總]÷(W×V÷V樣總)÷T=6.8×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管) ÷W

3)按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義:37中每104個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1 μ mol酚定義為1個(gè)酶活單位。AKP/ALP (μmol/min/104 cell)= [C標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V反總]÷(細(xì)胞數(shù)量×V÷V樣總)÷T= 6.8×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量

 

C標(biāo)準(zhǔn)品:2μmol/mLV反總:反應(yīng)體系總體積(mL),1020μL=1.02 mL; V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積(mL),0.020mL;V總:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時(shí)間(min),15 min。

 

注意事項(xiàng):

1.試劑二、試劑三和試劑四均需避光保存。

2.試劑四變藍(lán)綠色后不能再使用。

3.加入試劑四后必須立即混勻,否則顯色不完全。

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