NADH-輔酶Q 還原酶說明書,比色法
一、反應(yīng)原理
線粒體呼吸鏈復合物I通常稱為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶Q還原酶
(reduced nicotinamide adenine dinucleotide coenzyme Q reductase, NADH-CoQ
reductase),又稱為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶(reduced nicotinamide adenine
dinucleotide dehydrogenase;NADH dehydrogenase),是線粒體電子傳遞鏈中最大的結(jié)構(gòu)
成分:含有30至40多個多肽結(jié)構(gòu)。其特征性的酶活性是魚藤酮敏感的NADH-輔酶Q還
原酶(NADH:Q Reductase)。復合物I催化線粒體內(nèi)電子由供體NADH傳遞到內(nèi)膜上輔酶
Q受體(泛醌;ubiquinone)的能量轉(zhuǎn)移反應(yīng),為整個呼吸鏈反應(yīng)系統(tǒng)的第一步。基于
輔酶Q底物,在魚藤酮存在與否的情況下,通過NADH-輔酶Q還原酶的催化,轉(zhuǎn)化成
還原型泛醌(CoQH2),同時還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine
dinucleotide;NADH)轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine
dinucleotide;NAD),在分光光度儀下產(chǎn)生吸收峰值的變化(340nm 波長),由此定量
測定NADH-輔酶Q還原酶的特異活性。其反應(yīng)系統(tǒng)是:
NADH:Q Reductase NADH + H
+ + CoQ → NAD
- + CoQH2 二、試劑組成:(20 管/10 樣))
緩沖液(Reagent A)
反應(yīng)液(Reagent B)
陰性液(Reagent C)
底物液(Reagent D)
專性液(Reagent E)
產(chǎn)品說明書
20 毫升
2.5 毫升
2 毫升
500 微升
200 微升
1 份
三、保存方式
-20℃冰箱保存,避免反復凍融;反應(yīng)液(Reagent B)含有毒性物質(zhì),避免直接用
手接觸;反應(yīng)液(Reagent B)和底物液(Reagent D),避免光照,有效保證6月
四、用戶自備
比色皿:用于比色分析的容器
雙波長分光光度儀:用于比色分析
培養(yǎng)箱:用于孵育反應(yīng)物
五、實驗步驟
實驗開始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化;緩沖液
(Reagent A)室溫預熱;反應(yīng)液(Reagent B)和底物液(Reagent D)注意避光。然
后進行下列操作。
(一)、背景對照測定
1、移取 780 微升緩沖液(Reagent A)到新的比色皿
2、加入 100 微升反應(yīng)液(Reagent B)
3、加入 20 微升底物液(Reagent D)
4、放進 30℃培養(yǎng)箱里靜置 3 分鐘
5、加入 100 微升陰性液(Reagent C)
6、上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在 3 秒之內(nèi))
7、即刻放進分光光度儀檢測,此為背景空對照:
(340 波長讀數(shù)-380 波長讀數(shù))0 分鐘-(340 波長讀數(shù)-380 波長讀數(shù))1 分鐘或 3 分鐘
(二)、樣品總活性測定
1、移取 780 微升緩沖液(Reagent A)到新的比色皿
2、加入 100 微升反應(yīng)液(Reagent B)
3、加入 20 微升底物液(Reagent D)
4、放進 30℃培養(yǎng)箱里靜置 3 分鐘
5、加入 100 微升待測樣品(注意:10 微克總線粒體蛋白)
6、上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在 3 秒之內(nèi))
7、即刻放進分光光度儀檢測,此為樣品總活性讀數(shù):
(340 波長讀數(shù)-380 波長讀數(shù))0 分鐘-(340 波長讀數(shù)-380 波長讀數(shù))1 分鐘或 3 分鐘
(三)、樣品非特異活性測定
1、移取 760 微升緩沖液(Reagent A)到新的比色皿
2、加入 100 微升反應(yīng)液(Reagent B)
3、加入 20 微升專性液(Reagent E)
4、加入 20 微升底物液(Reagent D)
5、放進 30℃培養(yǎng)箱里靜置 3 分鐘
6、加入 100 微升待測樣品(注意:10 微克總線粒體蛋白)
7、上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在 3 秒之內(nèi))
8、即刻放進分光光度儀檢測,此為樣品非特異活性讀數(shù):
(340 波長讀數(shù)-380 波長讀數(shù))0 分鐘-(340 波長讀數(shù)-380 波長讀數(shù))1 分鐘或 3 分鐘
六、樣品活性計算
(1) 、樣品活性(總活性或非特異活性)
(樣本讀數(shù) - 背景讀數(shù))×體系容量(1ml)×樣本稀釋倍數(shù) 樣本蛋白濃度 ÷
樣本容量(0.1ml)×5.5(毫摩爾吸光系數(shù))×反應(yīng)時間(1或者3分鐘)
單位:μmol NADH/min/mgprot
(2) 、樣品特異活性
樣品總活性-樣品非特異活性=樣品特異活性
(mgprot/ml)
(蛋白濃度可通過用 總蛋白定量考馬斯亮藍法試劑盒測定)
我要詢價
*聯(lián)系方式:
(可以是QQ、MSN、電子郵箱、電話等,您的聯(lián)系方式不會被公開)
*內(nèi)容: