注 意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：
GCL 是 GSH 合成的限速酶，GSH 對(duì) GCL 有反饋抑制作用。GCL基因表達(dá)受多種因素調(diào)節(jié)，如氧化劑、抗氧化劑、生長因子和炎癥因子等。GCL活性高低對(duì)GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影響。
測(cè)定原理：
在ATP和Mg2+存在下，GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸；同時(shí)ATP去磷酸化產(chǎn)生無機(jī)磷分子，通過測(cè)定無機(jī)磷增加速率，即可計(jì)算出GCL活性。
自備儀器和用品：
可見分光光度計(jì)、冷凍離心機(jī)、水浴鍋、移液器、1mL玻璃比色皿、濃硫酸和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體70mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加14mL蒸餾水充分震蕩溶解。
試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入蒸餾水3.5 mL充分震蕩溶解。
試劑四：液體16mL×1瓶，室溫保存。
試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入30mL蒸餾水，充分震蕩溶解后，緩緩加入1.0 mL濃硫酸（自備），邊加邊攪拌。
粗酶液提�。�
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。
3. 血清等液體：直接測(cè)定。
GCL測(cè)定操作
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長到660 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 空白管：取1.5mLEp管，依次加入試劑一240 µL、試劑二260µL、試劑三60µL和蒸餾水120µL，混勻后蓋緊，37℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)15 min； 再加入試劑四300µL，混勻后，25℃、8000g，離心10 min，取上清500µL，加入試劑五500µL，混勻后蓋緊，45℃水浴10min，冷卻后測(cè)定660 nm處吸光值，記為A空白管。
3. 測(cè)定管：取1.5mLEp管，依次加入試劑一240 µL、試劑二260µL、試劑三60µL和上清液120µL，混勻后蓋緊，37℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)15 min； 再加入試劑四300µL，混勻后，25℃、8000g，離心10 min，取上清500µL，加入試劑五500µL，混勻后蓋緊，45℃水浴10min，冷卻后測(cè)定660 nm處吸光值，記為A測(cè)定管。
注意：空白管只需要測(cè)定一次。
