正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義
GOT( 2.6.1.1)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,催化可逆轉(zhuǎn)氨基反應(yīng),是氨基酸代謝的重要酶。此外,GOT在心肌細(xì)胞中含量最高,臨床上一般常作為心肌梗塞和心肌炎的輔助檢查。肝臟損害時(shí)其血清濃度也可升高。
測(cè)定原理
GOT催化 α-同戊二酸和天門冬氨酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨基反應(yīng),生成谷氨酸和草酰乙酸,草酰乙酸進(jìn)一步自行脫羧生成丙酮酸;丙酮酸可與2,4-二硝基苯肼反應(yīng)生成2,4-二硝基苯腙,在堿性條件下顯棕紅色;測(cè)定505nm吸光度的變化,即可計(jì)算GOT酶活力。
需自備的儀器和用品
可見分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制
提取液:液體30mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:液體5mL×1瓶, 4℃保存;
試劑二:液體5mL×1瓶, 4℃保存;
試劑三:液體50 mL×1瓶,4℃保存;
樣品測(cè)定的準(zhǔn)備
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
2、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。
測(cè)定操作表
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至505nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 在EP管中加入下列試劑
試劑名稱(μL) | 測(cè)定管 | 對(duì)照管 |
待測(cè)樣本 | 20 |
|
煮沸10min的待測(cè)樣本 |
| 20 |
試劑一 | 100 |
|
蒸餾水 |
| 100 |
混勻后,37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)準(zhǔn)確反應(yīng)20min
試劑二 | 100 | 100 |
混勻后,37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)準(zhǔn)確水浴20min
試劑三 | 1000 | 1000 |
混勻,室溫放置10min,在505nm波長(zhǎng)處,測(cè)各管吸光度A。ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。
計(jì)算
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸曲線, y = 0.4768x-0.0013 (x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度,umol/mL;y為ΔA)。
2、血清(漿)GOT活力的計(jì)算
單位的定義:每mL血清(漿)每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。
GOT(nmol/min/mL)=(ΔA+0.0013)÷0.4768÷T×103=104.9×(ΔA+0.0013)
3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中GOT活力的計(jì)算
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。
GOT(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0013)÷0.4786×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =104.9×(ΔA+0.0013)÷Cpr
需要另外測(cè)定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。
(2) 按樣本鮮重計(jì)算:
單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。
GOT(nmol/min/g鮮重)=[(ΔA+0.0013)÷0.4768×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103 =104.9×(ΔA+0.0013)÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
單位的定義:每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。
GOT(nmol/min/104 cell)=[(ΔA+0.0013)÷0.4768×V1]÷(500×V1÷V2)÷T×103 =0.21×(ΔA+0.0013)
V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.02mL;V2:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,20min;Cpr:蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬;103:1umol/mL=103 nmol/mL。
1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為:0.01 umol/mL -2 umol/mL。
2、 ΔA線性范圍為:0.01 -2。