- 介紹： 基 因 型TetrΔ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac Hte[F´proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr) Amy Camr]
- 簡(jiǎn) 要 說 明XL10-Gold是目前轉(zhuǎn)化效率最高的感受態(tài)細(xì)胞，由Stratagene開發(fā)的特異性用于大質(zhì)�；蛘滟F連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化或構(gòu)建文庫的超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞。XL10-Gold菌株為Hte(high transformation efficiency)基因型，Hte是Stratagene開發(fā)的特異性提高感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率及大質(zhì)粒轉(zhuǎn)化能力的宿主菌基因型，已成功應(yīng)用于40kd質(zhì)粒的構(gòu)建。[Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173]賦予XL10-Gold缺失幾乎所有已知的限制酶切系統(tǒng)；同時(shí)缺失核酸內(nèi)切酶(endA)，提高了質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量；重組酶缺陷型(recA)減少插入片段的同源重組概率，保證了插入DNA的穩(wěn)定性；Tetr， Camr賦予菌株四環(huán)素和氯霉素抗性；lacIqZΔM15的存在使XL10-Gold可用于藍(lán)、白斑篩選。 High5TM系列XL10-Gold感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，經(jīng)pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>2×109cfu/μg。
- 操 作 說 明
- 1.0.1cm電擊杯和杯蓋從儲(chǔ)存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發(fā)，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實(shí)冰面，電極杯頂離冰面0.5cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。
- 2.取-80℃保存的XL10-gold電擊感受態(tài)細(xì)胞插入冰中5分鐘，待其融化，加入目的DNA(質(zhì)�；蜻B接產(chǎn)物)并用手撥打 EP 管底輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，立即插入冰中。A.測(cè)定轉(zhuǎn)化效率使用 1 μl 10 pg/μl 的對(duì)照質(zhì)粒 pUC19；B.對(duì)于連接產(chǎn)物，請(qǐng)用乙醇沉淀 DNA 后加入適量 TE 緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸，DNA 濃度不超過 100 ng/μl，體積不超過 5 μl/50 μl 感受態(tài)。
- 3.用 200 μl 槍頭(用刀切除 0.5cm 槍尖)將感受態(tài)-DNA 混合物快速移到電擊杯中，避免產(chǎn)生氣泡，蓋上杯蓋。
- 4.啟動(dòng)電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此為 BioRad 電轉(zhuǎn)儀推薦參數(shù)，也可按所用 電轉(zhuǎn)儀推薦的參數(shù)操作），將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中，電擊完成快速插入冰中。
- 5.立即 向電擊杯中加入1000 μl不含抗生素的無菌培養(yǎng)基 S.O.C.，混勻后轉(zhuǎn)移到空50ml管中，并用1ml SOC輕柔沖洗電轉(zhuǎn)杯并轉(zhuǎn)移到50ml管中，另補(bǔ)加3ml SOC培養(yǎng)基， 37℃，200 rpm復(fù)蘇60分鐘。6.5000 rpm 離心一分鐘收菌，重懸后取 100-200 μl 涂布到含相應(yīng)抗生素的 S.O.C 平板上（因菌量較大， 若全部涂板請(qǐng)選用直徑 15cm 培養(yǎng)皿 2-5 個(gè)）。將平板倒置放于 37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)過夜。
- 注 意 事 項(xiàng)
- 1. 加入DNA 時(shí)體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10。
- 2. 電擊感受態(tài)細(xì)胞加入電擊杯應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)增加弧光放電風(fēng)險(xiǎn)。
- 3. 當(dāng)DNA 不純或存在鹽，乙醇，蛋白及緩沖液等污染時(shí)，轉(zhuǎn)化效率急劇下降。
- 4. 電擊杯里的離子可增加溶液的電導(dǎo)，增大在含有細(xì)胞和DNA 的溶液中產(chǎn)生電流和弧光放電的風(fēng)險(xiǎn)。
- 5. 若轉(zhuǎn)化大質(zhì)�；蛳氆@得較高轉(zhuǎn)化效率，推薦使用高純質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)數(shù)量級(jí)。
- 6. 對(duì)于連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，最好轉(zhuǎn)化前乙醇沉淀DNA 后用適量TE 緩沖液(10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸產(chǎn)物，保證DNA 濃度不超過100 ng/μl。過高濃度連接產(chǎn)物或過大體積連接產(chǎn)物會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率，增加弧光放電的風(fēng)險(xiǎn)。
- 7. 混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作，吸取感受態(tài)細(xì)胞時(shí)避免用力過猛，以免剪切力過大損傷細(xì)胞膜，降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒或連接產(chǎn)物可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。
- 8. 電擊感受態(tài)細(xì)胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期儲(chǔ)存會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率會(huì)下降。
- 儲(chǔ)存條件： -80℃
- 用途： 克隆感受態(tài)細(xì)胞
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