- 介紹： 基因型:F- mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80lacZM15 lacX74 recA1 endA1 araD139 (ara, leu)7697 galE15 galK λ- rpsL nupG
- 簡 要 說 明
- High5TM系列DH10B感受態(tài)細(xì)胞只能用于電擊轉(zhuǎn)化而不能用于熱激轉(zhuǎn)化。DH10B菌株來源于MC1061菌株，mcrA、mcrBC及mrr突變使DH10B菌株適合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA ，無論真核生物還是原核生物的基因組DNA都能被高效的轉(zhuǎn)入DH10B中。recA1和endA1的突變有利于插入DNA的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA的提取。φ80dlacZ∆M15標(biāo)記的存在使DH10B可用于藍(lán)白斑篩選，rpsL賦予其鏈霉素抗性。High5TM系列DH10B感受態(tài)細(xì)胞適用于大質(zhì)粒的構(gòu)建或者各種文庫構(gòu)建。High5TM系列DH10B感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，經(jīng) pUC19質(zhì)粒檢測，轉(zhuǎn)化效率>1010cfu/μg。
- 操 作 說 明
- 1. 0.1cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發(fā)，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。
- 2. 取-80℃保存的High5TM 系列DH10B感受態(tài)細(xì)胞放入冰浴中融化，加入1 μl目的DNA (質(zhì)粒或連接產(chǎn)物)并用手撥打EP管底輕輕混勻立即插入冰中。A. 測定轉(zhuǎn)化效率使用1 μl 10 pg/μl的對照質(zhì)粒pUC19；B. 對于連接產(chǎn)物，請用乙醇沉淀DNA后適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸，保證DNA濃度不超過100 ng/μl。
- 3. 用200 μl槍頭將感受態(tài)-質(zhì)粒混合物快速移到電擊杯中，避免產(chǎn)生氣泡，蓋上杯蓋。
- 4. 啟動電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 Ω，V=2.4 kV (此為BioRad 電轉(zhuǎn)儀推薦參數(shù)，使用者也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的參數(shù)操作），將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中，電擊完成快速插入冰中。5. 立即 向電擊杯中加入1ml不含抗生素的無菌培養(yǎng)基 S.O.C.，混勻后轉(zhuǎn)移到空50ml管中，并用1ml SOC輕柔沖洗電轉(zhuǎn)杯并轉(zhuǎn)移到50ml管中，另補加3ml SOC培養(yǎng)基， 37℃，200 rpm復(fù)蘇60分鐘。6. 5000rpm離心一分鐘收菌，重懸后取100-200 μl涂布到含相應(yīng)抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。如果進(jìn)行藍(lán)白斑篩選操作，將平板放37℃培養(yǎng)至少13h。注 意 事 項1.加入質(zhì)粒時體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10。2.當(dāng)質(zhì)粒不純或存在鹽，乙醇，蛋白及緩沖液等污染時，轉(zhuǎn)化效率急劇下降。3.若轉(zhuǎn)化大質(zhì)�；蛳氆@得較高轉(zhuǎn)化效率，推薦使用高純質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個數(shù)量級。4.對于連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，最好轉(zhuǎn)化前用乙醇沉淀DNA后適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.
- 5; 1 mM EDTA)重懸產(chǎn)物，保證DNA濃度不超過100 ng/μl。過高濃度連接產(chǎn)物或過大體積連接產(chǎn)物會降低轉(zhuǎn)化效率，增加打火的風(fēng)險。5.混入質(zhì)粒時應(yīng)輕柔操作。6.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)�？上鄳�(yīng)減少最終用于涂板的菌量。
- 儲存條件： -80℃
- 用途： 克隆感受態(tài)細(xì)胞
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