使用說(shuō)明：
1. 樣品的制備。
a. 選擇合適的裂解液，用于制備細(xì)胞或組織的裂解液。優(yōu)先推薦選擇我司生產(chǎn)的P0013 Western及IP細(xì)胞裂解液用于細(xì)胞或組織樣品的裂解。根據(jù)特定的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模缬斜匾�，也可以使�?/span>我司生產(chǎn)的P0013B RIPA裂解液(強(qiáng))、P0013C RIPA 裂解液(中)或P0013D RIPA裂解液(弱)用于樣品的制備。如果使用自行配制的或其它公司生產(chǎn)的裂解液，需要確保裂解液的pH為6-8。
b. 具體的細(xì)胞或組織樣品裂解的制備步驟請(qǐng)參考裂解液的使用說(shuō)明。制備好的裂解液上清宜置于冰上或4ºC存放，隨后即可用于免疫沉淀或免疫共沉淀、標(biāo)簽蛋白的純化等操作。新鮮制備好的樣品，建議盡量當(dāng)天完成免疫沉淀等后續(xù)操作， 但如果樣品不能當(dāng)天使用，也可以適當(dāng)分裝后-80ºC凍存。
2. Anti-Flag磁珠的準(zhǔn)備。
由于Anti-Flag磁珠儲(chǔ)存在特殊保護(hù)液中，所以需要在加入樣品前適當(dāng)洗滌。
a. 用移液器輕輕吹打重懸Anti-Flag磁珠，按照每500μl樣品10μl或20μl磁珠懸濁液，取適量Anti-Flag磁珠至一潔凈離心管中(FTUB015)，加入1X TBS (ST661/ST665)至最終體積為約0.5ml。說(shuō)明：如果初始體積大于0.2ml，可以考慮先直接置于磁力架(FMS012/FMS024)上分離10秒，去除上清，然后再加入1X TBS (ST661/ST665)至最終體積為約0.5ml。
b. 用移液器輕輕吹打重懸Anti-Flag磁珠。置于磁力架(FMS012/FMS024)上分離10秒，去除上清。重復(fù)上述步驟兩次。
c. 按照初始體積的量，用1X TBS (ST661/ST665)重懸Anti-Flag磁珠。
3. 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP):
a. 加入磁珠與孵育。按照每500μl蛋白樣品加入10μl或20μl磁珠懸濁液的比例加入Anti-Flag磁珠，置于側(cè)擺搖床或旋轉(zhuǎn)混合儀上，室溫孵育2小時(shí)或4ºC孵育過(guò)夜。注：孵育過(guò)程中，如果磁珠發(fā)生聚團(tuán)或呈片狀屬正�，F(xiàn)象，不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
b. 磁分離。孵育完畢后，置于磁力架上分離10秒，去除上清。注：可保留部分上清液，用于檢測(cè)免疫沉淀的效果。
c. 洗滌。加入500μl的1X TBS，用移液器輕輕吹打重懸Anti-Flag磁珠。置于磁力架上分離10秒，去除上清。重復(fù)洗滌三次。注：也可以通過(guò)檢測(cè)洗滌得到的洗滌液的OD280來(lái)判斷是否洗滌完全，若OD280大于0.05，應(yīng)適當(dāng)增加洗滌次數(shù)。
4. 洗脫：
根據(jù)標(biāo)簽蛋白的特點(diǎn)及后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，可以選擇如下3種方法之一進(jìn)行洗脫。
a. 3X Flag競(jìng)爭(zhēng)洗脫法：本方法為非變性法，洗脫效率高，且洗脫后的蛋白保持原有的生物活性，便于后續(xù)分析檢測(cè)。
(a) 3X Flag多肽洗脫液的配制：取適量3X Flag多肽(P9801)溶解于1X TBS中，使其終濃度為150μg/ml，或稀釋5mg/ml的3X Flag多肽溶液(P9801)至150μg/ml。
(b) 每10-20μl原始磁珠體積，加入100μl 3X Flag多肽洗脫液(150μg/ml)，混勻后置于側(cè)擺搖床或旋轉(zhuǎn)混合儀上，室溫?fù)u晃孵育30-60分鐘，或4ºC孵育1-2小時(shí)。為了提高洗脫效率，可延長(zhǎng)孵育時(shí)間或重復(fù)洗脫。
(c) 孵育完畢后，置于磁力架上分離10秒，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中。上清即為洗脫的Flag標(biāo)簽蛋白。
(d) 洗脫的Flag標(biāo)簽蛋白置于4ºC待用，或者-20ºC或-80ºC長(zhǎng)期保存。
b. 酸性洗脫法：本方法為非變性法，比較快速且高效。洗脫后的蛋白保持原有的生物活性，便于后續(xù)分析檢測(cè)。
(a) 溶液的配制：酸性洗脫液(0.1M Glycine-HCl, pH3.0)，中和液(0.5M Tris-HCl, pH7.4, 1.5M NaCl)。
(b) 每10-20μl原始磁珠體積，加入100μl酸性洗脫液，混勻后置于側(cè)擺搖床或旋轉(zhuǎn)混合儀上，室溫孵育5分鐘。注：孵育時(shí)間不宜超過(guò)15分鐘。
(c) 孵育完畢后，置于磁力架上分離10秒，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，并立刻加入10μl中和液，適當(dāng)混勻。
(d) 為了獲得最大的洗脫效率，可重復(fù)步驟b和c，并將相同樣品合并。
(e) 洗脫并中和的Flag標(biāo)簽蛋白置于4ºC待用，或者-20ºC或-80ºC長(zhǎng)期保存。
注1：酸性洗脫法雖然高效，但仍可能低于競(jìng)爭(zhēng)洗脫法或SDS-PAGE上樣緩沖液洗脫法。
注2：由于目的蛋白的差異可能對(duì)酸性洗脫法的洗脫效率有一定的影響，如果對(duì)洗脫效率的要求比較高，可對(duì)酸性洗脫液的pH在2.5-3.1之間進(jìn)行一定的調(diào)整，相應(yīng)的中和液的pH值或量也要進(jìn)行一定的調(diào)整，例如100μl酸性洗脫液(0.1M Glycine-HCl, pH2.8)和15μl中和液(1M Tris-HCl, pH8.5)。
c. SDS-PAGE上樣緩沖液洗脫法：本方法為變性法，得到的蛋白樣品適合SDS-PAGE電泳或WB檢測(cè)。
(a) SDS-PAGE上樣緩沖液的配制：可以直接使用我司生產(chǎn)的P0015A SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(1X)，或使用我司生產(chǎn)的P0015 SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)或自行參考《分子克隆》等配制5X或2X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，然后加入水配制成1X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。通常SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液含有DTT等還原劑，其洗脫得到的蛋白樣品中會(huì)含有Flag抗體的輕鏈和重鏈。
(b) 每10-20μl原始磁珠體積的磁珠，加入100μl 1X SDS-PAGE上樣緩沖液，95ºC加熱5分鐘。
(c) 置于磁力架上分離10秒，取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳或Western檢測(cè)。
保存條件：
4ºC保存，兩年有效。長(zhǎng)期不使用，可以-20ºC保存，-20ºC可以保存更長(zhǎng)時(shí)間。
注意事項(xiàng)：
Ø 本產(chǎn)品經(jīng)測(cè)試，反復(fù)凍融3次以上，不影響使用效果。
Ø 本產(chǎn)品需維持pH為6-8，避免高速離心、干燥或凍存；請(qǐng)勿長(zhǎng)時(shí)間將磁珠置于磁場(chǎng)中，否則可能會(huì)引起磁珠聚團(tuán)。
Ø 本產(chǎn)品使用前要適當(dāng)充分重懸，即顛倒若干次使磁珠混合均勻，混勻操作須輕柔，不宜劇烈渦旋震蕩等，避免抗體變性等。
Ø 在免疫沉淀或純化時(shí)，建議設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照組。
Ø 蛋白樣品收集后宜盡快完成純化工作，并應(yīng)始終放置在4ºC或冰浴，以減緩蛋白降解或變性。為有效抑制蛋白降解，可以在蛋白樣品中添加適量的蛋白酶抑制劑混合物，例如我司的P1005/P1006蛋白酶抑制劑混合物(通用型)、P1048/P1049 蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物(通用型, 質(zhì)譜兼容, 50X)、P1010/P1011 蛋白酶抑制劑混合物(哺乳動(dòng)物樣品抽提用, 100X)、P1050/P1051 蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物(哺乳動(dòng)物樣品抽提用, 50X)等。
Ø 如果使用真空泵等儀器吸取上清液，須注意真空泵的吸液強(qiáng)度，以免吸力過(guò)大而吸取到聚集的磁珠。
Ø 酸性溶液洗脫時(shí)磁珠可能會(huì)發(fā)生聚集，屬于正�，F(xiàn)象，不影響磁珠的正常使用。0.1%的非離子型去垢劑(如Triton X-100、Tween-20或NP-40)可有效防止磁珠聚集，并且不會(huì)影響磁珠的抗體結(jié)合效率。
Ø 高濃度的DTT、巰基乙醇、鹽酸胍等對(duì)本產(chǎn)品與標(biāo)簽蛋白的結(jié)合可能有一定影響，但Western及IP細(xì)胞裂解液(P0013)、RIPA 裂解液(P0013B/C/D)或NP-40裂解液(P0013F)等都完全適用。
Ø 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
Ø 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
