注意:正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
土壤亞硝酸還原酶試劑盒可見分光光度法測定意義
土壤亞硝酸還原酶是反硝化作用中的關(guān)鍵酶之一,參與亞硝酸鹽至 NO 的還原反應(yīng),它的活性反映了生物降解過程中氮素的轉(zhuǎn)化效率,為氮素轉(zhuǎn)化規(guī)律的研究提供一定的依據(jù)。
測定原理
亞硝酸還原酶可將NO2-還原為 NO,使樣品中參與重氮化反應(yīng)生成紫紅色化合物的NO2-減少,即 540nm處吸光值的變化可反應(yīng)土壤中亞硝酸還原酶的活性。
需自備的儀器和用品
天平、可見分光光度計、水浴鍋、低溫離心機、1mL 玻璃比色皿。
試劑的組成和配制
試劑一:液體 10mL×1 瓶,4℃保存。
試劑二:粉劑×1 瓶,4℃保存。臨用前加 10mL 蒸餾水溶解。
試劑三:液體 10mL×1 瓶,4℃保存。
試劑四:液體 25mL×1 瓶,4℃避光保存。(使用前50℃加熱溶解)
試劑五:液體 25mL×1 瓶,4℃避光保存。
工作液:臨用前根據(jù)用量將試劑四和試劑五以 1:1 的比例混合。
測定操作表
土樣自然風(fēng)干或35℃烘干
| 空白管 | 對照管 | 測定管 |
風(fēng)干土樣(g) |
| 0.1 | 0.1 |
蒸餾水(μL) |
| 200 |
|
試劑一(μL) | 200 |
| 200 |
試劑二(μL) | 200 | 200 | 200 |
混勻后,25℃反應(yīng) 1h | |||
試劑三(μL) | 200 | 200 | 200 |
充分震蕩 30S,10000rpm,4℃,離心 10min | |||
上清液(μL) | 500 | 500 | 500 |
工作液(μL) | 1000 | 1000 | 1000 |
充分混勻,室溫靜置顯色10min,用蒸餾水調(diào)零,于1mL玻璃比色皿中測定540nm各管吸光值,分別記為 A 空白管、A 對照管、A 測定管。 |
計算公式
標(biāo)準(zhǔn)曲線:y =0.0129x - 0.0106,R2 =0.9985
酶活單位定義:每g土樣每24h還原1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
S-NiR(μmol/d/g)=[A 空白管-(A 測定管-A 對照管)+0.0106]÷0.0129×V 反總÷W÷T
=930.23×[A 空白管-(A 測定管-A 對照管)+0.0106]÷W
V 反總:反應(yīng)體系總體積,0.5mL;T:反應(yīng)時間,1h=1/24d;W:樣本質(zhì)量,g。
注意事項
1、 配制好的試劑二和工作液3天內(nèi)使用完。
2、 若吸光值超過2,將上清液進行適當(dāng)?shù)南♂尯笤偌尤牍ぷ饕猴@色,并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
3、 嚴格控制顯色時間,否則會對結(jié)果有影響。