注 意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義:
銅藍蛋白是血漿的含銅蛋白,有運輸銅的功能,同時具有氧化酶的活性,是細胞外液重要的抗氧化劑。
測定原理:
銅藍蛋白催化3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺生成藍色產物,在645nm處有特征吸收峰,依此可得銅藍蛋白活性。
自備實驗用品及儀器:
天平、可見分光光度計、1 mL玻璃比色皿和蒸餾水。
試劑組成和配制:
試劑一:液體15mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:液體10mL×1瓶,4℃保存。
試劑三:液體20mL×1瓶,4℃避光保存。(使用前37℃預熱)
測定操作表:
1、 血清(漿)等液體樣本:直接檢測。
2、 動植物組織樣本:稱取約0.1g組織,加入1mL蒸餾水,進行冰浴勻漿。10000g ,4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
| 空白管 | 測定管 |
樣品(µL) | 100 | 100 |
試劑一(µL) | 300 | 300 |
試劑二(µL) | 200 |
|
混勻,37℃預熱5min | ||
試劑三(µL) | 400 | 400 |
混勻,37℃反應30min | ||
試劑二(µL) |
| 200 |
混勻,25℃放置5min,1 mL玻璃比色皿,空白管調零,測定OD645 |
計算公式:
1、 按體積計算
單位定義:37℃條件下,每分鐘每毫升樣品與底物作用吸光值升高0.01為一個酶活單位。
Cp活力(U/mL)×V反總÷V樣÷T=33.33×OD645
2、 按鮮重計算
單位定義:37℃條件下,每分鐘每克樣品與底物作用吸光值升高0.01為一個酶活單位。
Cp活力(U/g鮮重)=×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T=33.33×OD645÷W
3、 按蛋白濃度計算
單位定義:37℃條件下,每分鐘每毫克蛋白樣品與底物作用吸光值升高0.01為一個酶活單位。
Cp活力(U/mg prot)=×V反總÷(Cpr×V樣)÷T=33.33×OD645÷Cpr
V樣:0.1 mL;V反總:1 mL;T:反應時間,30min;V樣總:加入提取液體積,1mL; Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g
注意事項:
試劑二和試劑三有一定的毒性和刺激性,請操作時做好防護措施。