超氧陰離子清除能力測試盒測定意義
超氧陰離子自由基作為生物體代謝過程中產(chǎn)生的一種自由基，可攻擊生物大分子，如脂質(zhì)、 蛋白質(zhì)、核酸和聚不飽和脂肪酸等，使其交鏈或者斷裂，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，與機(jī) 體衰老和病變有很密切的關(guān)系，清除超氧陰離子自由基的研究已經(jīng)得到了廣泛的關(guān)注。
測定原理
AP-TEMED 系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子，與鹽酸羥胺反應(yīng)生成 NO2－，NO2－與對氨基苯磺酸和 α－ 萘胺的作用生成紅色的偶氮化合物，在 530nm 處有特征吸收峰，樣品對超氧陰離子的清除 能力與 530nm 的吸光值呈負(fù)相關(guān)。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器
天平、研缽、低溫離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、恒溫水浴鍋。
試劑組成和配制
提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。
試劑一：液體 1mL×1 支，4℃避光保存。
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃避光保存。臨用前加 4mL 蒸餾水充分溶解。
試劑三：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。
試劑四：液體 5mL×1 瓶，4℃避光保存。
試劑五：液體 5mL×1 瓶，4℃避光保存。
樣品處理
1. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g，加入 1mL
提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于 4℃，10000g 離心 10min，取上清置于冰上待測。
2. 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500
萬細(xì)胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，
總時(shí)間 3min）；然后 4℃，10000g 離心 10min，取上清置于冰上待測。
3. 培養(yǎng)液或其它液體：直接檢測。
4. 粉劑藥物可配制成相同濃度，比如 1mg/mL。
測定操作
空白管 對照管 測定管
試劑一（μL） 10 10 10
試劑二（μL） 40 40
H2O（μL） 65 25
充分混勻，25℃反應(yīng) 1min
樣品（μL） 25
試劑三（μL） 50 50 50
充分混勻，37℃反應(yīng) 30min
試劑四（μL） 50 50 50
試劑五（μL） 50 50 50
充分混勻，37℃顯色 20min，于微量石英比色皿/96 孔板，以空白管調(diào)零，在 530nm 處測定
對照管和測定管的吸光值，分別記為 A 對照管和 A 測定管。
注意：空白管只需測定一次。
計(jì)算公式
超氧陰離子清除率 I%= 100%
A
A - A
對照管
對照管 測定管
注意事項(xiàng)
1. 試劑一 4℃可保存 2 個(gè)月，配制好的試劑二 4℃可保存一周，建議實(shí)驗(yàn)前配制，并盡快
使用。
2. 樣品處理完后立即進(jìn)行測定，或者低溫保存不超過 24 小時(shí)。
