注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：細(xì)胞色素P450酶是一組在外源物質(zhì)代謝中，尤其是藥物和毒物，具有重要作用的酶系。AND作為P450酶系的重要一員，相當(dāng)于CYP3A4亞型，與藥物的去甲基化反應(yīng)密切相關(guān)。

測(cè)定原理：

AND催化氨基比林釋放甲醛，通過(guò)Nash比色法測(cè)定甲醛含量，即可計(jì)算出AND活性。

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、普通離心機(jī)，超速離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、1mL玻璃比色皿、蒸餾水、無(wú)水乙醇和冰。

試劑組成和配制：

試劑一：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加50mL蒸餾水充分溶解。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶（棕色瓶），4℃避光保存。臨用前加入2.6 mL無(wú)水乙醇，充分溶解。

試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入2.6 mL蒸餾水，充分溶解。

試劑五：粉劑×1瓶，室溫保存。臨用前加蒸餾水10mL充分溶解。

試劑六：液體×1瓶，室溫保存。

試劑七：液體×1瓶，4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)液：液體×1瓶，-20℃保存。臨用前取1.5 mL EP 管，加入10μl標(biāo)準(zhǔn)液，加990μl蒸餾水，混勻即為0.05 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)甲醛溶液，4℃保存。

粗酶液提取：

1、除去細(xì)胞核，線粒體等大分子物質(zhì)：稱(chēng)約0.5g組織，加入1 mL試劑一，冰上充分研磨，10 000g 4℃離心30min，取上清液轉(zhuǎn)入超速離心管。

2、粗制微粒體：4℃，100 000g，離心60min，棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟2的沉淀中加1mL試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g離心30min，棄上清液。

4、最終微粒體：向步驟3的沉淀中加試劑二0.5 mL，蓋緊后充分震蕩溶解，即粗酶液，待測(cè)。該待測(cè)液需當(dāng)天使用。

AND活性測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到412 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二置于37℃水浴中預(yù)熱30min。

3. 對(duì)照管：取1支EP管，加入50μL粗酶液，850μL試劑二，50μL試劑三，50μL蒸餾水，混勻后置于37℃水浴保溫30min；立即加入175μL試劑五，混勻后置于冰浴中5min；取出后加入175μL試劑六，混勻后室溫靜置5min；室溫8000rpm離心5min；取新的EP管，加入500μL上清液，500μL試劑七，混勻后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷卻5min，于412nm測(cè)定光吸收，記為A對(duì)照管。

4. 測(cè)定管：取1支EP管，加入50μL粗酶液，850μL試劑二，50μL試劑三，50μL試劑四，混勻后置于37℃水浴保溫30min；立即加入175μL試劑五，混勻后置于冰浴中5min；取出后加入175μL試劑六，混勻后室溫靜置5min；室溫8000rpm離心5min；取1支新EP管，加入500μL上清液，500μL試劑七，混勻后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷卻5min，于412nm測(cè)定光吸收，記為A測(cè)定管。

5. 標(biāo)準(zhǔn)管：取1支EP管，加入500μL標(biāo)準(zhǔn)品，500μL試劑七，混勻后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷卻5min，于412nm測(cè)定光吸收，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。

注意：每個(gè)樣品都需要做對(duì)照管。

AND活性計(jì)算：

(1).按照蛋白濃度計(jì)算:

活性單位定義：37℃中每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生1nmol甲醛為1個(gè)酶活單位。

AND活性(nmol/min/mg prot)= C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷A標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V樣）÷T

= 45×（A測(cè)定管－A空白管）÷A標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr

(2).按照樣本質(zhì)量計(jì)算:

活性單位定義：37℃中每分鐘每克樣品催化產(chǎn)生1nmol甲醛為1個(gè)酶活單位。

AND活性(nmol/min/g 鮮重)= C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷A標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷(W×V樣)÷T

= 45×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷A標(biāo)準(zhǔn)管÷W

C標(biāo)準(zhǔn)品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V標(biāo)準(zhǔn)品：500μL=0.0005 L；稀釋倍數(shù)：V反總÷V上清液=（50+850 +50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度mg/mL，需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒；V樣：加入粗酶液體積，50μL=0.05mL；W：樣本質(zhì)量，g ；T：反應(yīng)時(shí)間，30min。

注意事項(xiàng)：

1、粗酶液需在當(dāng)日完成測(cè)定，如需保存，則向粗酶液提取步驟3的沉淀中加0.5ml 20%的甘油，分裝后，-80℃保存；

2、試劑三和試劑四需臨用前配制，如當(dāng)天沒(méi)有用完，4℃避光保存，可用1周；

3、粗酶液可直接用于蛋白濃度測(cè)定，建議用BCA法測(cè)蛋白含量。