pUCm-T 載體 & PCR 產(chǎn)物克隆試劑盒
產(chǎn)品編號： B620433_B620435
包裝規(guī)格： B620433, 20 次/100 次； B620435, 20 次/100 次
試劑盒組成
組分
B620433
20 次
B620433
100 次
B620435
20 次
B620435
100 次
pUCm-T vector 1 µg 5 µg 1 µg 5 µg
10¥Ligation Buffer 50 µl 200 µl
50% PEG4000 50 µl 200 µl
T4 DNA Ligase, 5U/µl 100 U 500 U
Sterilized ddH2O 1 ml 1 ml
產(chǎn)品介紹
T-載體 PCR 產(chǎn)物克隆試劑盒適用于克隆帶有 3’ 末端 A 突出的的 PCR 產(chǎn)物。本試劑盒提供的獨(dú)特連接系統(tǒng)允許用戶在
1~2 小時內(nèi)的時間里完成連接反應(yīng)。
本公司的 pUCm-T 載體是為簡化 PCR 產(chǎn)物的克隆而設(shè)計的。許多熱穩(wěn)定的 DNA 聚合酶，如 Taq DNA 聚合酶、Tth DNA
聚合酶等擴(kuò)增的 PCR 產(chǎn)物在 3’末端后都帶有一個突出的堿基 A，這樣的 PCR 產(chǎn)物很容易連接到帶有突出堿基 T的 T載體上。
Sangon 生產(chǎn)的 pUCm-T 是一種新穎的 pUC 系列 T 載體，其多克隆位點(diǎn)大多是單切點(diǎn)，以及 β-半乳糖苷酶讀碼框的調(diào)
整，大大方便了克隆的藍(lán)/白篩選。插入位點(diǎn)兩端獨(dú)特設(shè)計的兩個 PstI 位點(diǎn)使插入片段可以用 Pst I 單酶切進(jìn)行檢測，也可以
用非常廉價而高效的 EcoR I 和 Hind III 雙酶切進(jìn)行檢測。可以用 M13 通用引物和 T7 啟動子引物對 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序。
pUCm-T 含有 T7 RNA 聚合酶的啟動子，可以對插入片段進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。
本文末列出了 pUCm-T 相關(guān)的技術(shù)資料，其全序列可參照 pUC19（GenBank Accession Number M77789），只是其多
克隆位點(diǎn)部分的序列有所不同。
連接反應(yīng)的準(zhǔn)備
PCR 產(chǎn)物是否需要純化取決于擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量。如果 PCR 產(chǎn)物特異性很高，則不需要對產(chǎn)物進(jìn)行純化。但是如果將質(zhì)
粒作為模板，則需要對 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化，因?yàn)橘|(zhì)粒模板在轉(zhuǎn)化后會形成白色的菌落。PCR 產(chǎn)物可通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)
行分離。本公司的 PCR 產(chǎn)物膠回收試劑盒(B610353) 可有效回收>60 bp 的 DNA 片段。
Taq、Tth、AmpliTaq、KlenTaq DNA 聚合酶擴(kuò)增的 PCR 產(chǎn)物會在 3’末端添加堿基 A。Taq DNA 聚合酶同具有 3’Æ5’ 外
切酶活性的 Pfu、Pwo、Tli 或 Deep vent DNA 聚合酶共同擴(kuò)增的產(chǎn)物也可能會在 3’末端添加堿基 A。PCR 產(chǎn)物 3’端含有突
出的堿基 A 可以被連接到 pUCm-T 上。具有 3’Æ5’ 外切酶活性的 DNA 聚合酶擴(kuò)增的 PCR 產(chǎn)物為平末端，克隆這樣的片段
需要在平末端加 A。
本公司的 A-Tailing Kit（B620513）可有效地在 3’末端添加堿基 A。
連接反應(yīng)
1. 在一個標(biāo)準(zhǔn)的10 µl連接反應(yīng)體系中，加入50ng (1 µl) pUCm-T vector、0.2 pmol PCR產(chǎn)物、1 µl 10¥ligation Buffer 和1
µl T4 DNA Ligase, 并加入ddH2O至終體積為10 µl，通常不需要對PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量。連接反應(yīng)體系可根據(jù)如下進(jìn)行配
制：
1 µl 10¥Ligation Buffer
1 µl 50%PEG
Sangon Biotech
1 µl pUCm-T vector
X µl 純化的 PCR 產(chǎn)物
Y µl Sterilized water
1 µl T4 DNA Ligase
10 µl (Final Volume)
注意： T4 DNA Ligase 最后加。
2. 16~23°C連接1 h~過夜。
注意：常規(guī)實(shí)驗(yàn) 1 h 已足夠。
轉(zhuǎn)化
推薦使用本公司的 Competent Cell Preparation Kit (B620523 或 B620525)
1. 將100 µl 感受態(tài)細(xì)胞冰上解凍，完全溶解后輕輕混勻 。
2. 加入5 µl上述連接液，輕輕混勻，冰上放置30 min。
3. 42°C 水浴熱激1.5 min。再在冰上放置 2~10 min。
4. 加入400 µl LB 培養(yǎng)基，37°C 200~250 rpm振蕩培養(yǎng)1 h。
5. 4000 rpm離心5min，用槍頭吸掉400 µl上清液，用剩余的培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸。
6. 將細(xì)菌懸液均勻涂布在含有20 μl IPTG（100 mM）和100 μl X-gal（20 mg/ml）的氨芐青霉素抗性的LB平板上。
注意：使用細(xì)菌的數(shù)量取決于連接和轉(zhuǎn)化的效率。
7. 將平板在37°C正向放置 1 小時后吸掉過多的液體， 倒置培養(yǎng)過夜。
篩選
通過藍(lán)/白斑篩選轉(zhuǎn)化子
當(dāng)外來 DNA 片段被克隆進(jìn) pUCm-T時，LacZ 基因讀碼框的編碼序列被插入的外來 DNA 改變，因此a-序列的活性被影響，，
重組克隆可在 X-gal/IPTG 平板上通過顏色進(jìn)行篩選，未發(fā)生重組克隆的菌落為藍(lán)色。用牙簽挑選 IPTG/X-gal 平板上的白色
菌落，轉(zhuǎn)移到含 Amp+的液體培養(yǎng)基 37°C 過夜培養(yǎng)。
轉(zhuǎn)化子的鑒定
1. 從含白色菌落的液體培養(yǎng)基中提取質(zhì)粒，用PstI 或其它合適的限制性內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒，檢測插入片段的大小，以證明該
菌落是否含有目的片段。
2. 克隆的目的片段可使用M13通用引物或其它合適的引物進(jìn)行測序，進(jìn)一步證明該菌落含有目的片段。
附錄
1. A. pUCm-T載體圖譜 Sangon Biotech
2. UCm-T載體啟動子和多克隆位點(diǎn)序列
M13/pUC Sequencing Primer(-20) EcoR I Sac I Kpn I T7 Transcription Start Nde I
T7 Promoter
5’-G TTG TAA AAC GAC GGC CAG TGA ATT CGA GCT CGG TAC CGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GCG ACA TAT
GAT
3’-C AAC ATT TTG CTG CCG GTC ACT TAA GCT CGA GCC ATG GCA TTA TGC TGA GTG ATA TCC CGC TGT ATA CTA
A
PCR Products
Cla I EcoR V Nco I Not I Pst I A Bgl II BamH I Xho I
CGA TGA TAT CCC ATG GGC GGC CGC CTG CAG ACC AGG TCT AGA CTG GAG ATC TGG ATC CCT CGA
GTC
GCT ACT ATA GGG TAC CCG CCG GCG GAC GTC TGG TCC AG T TCT GAC CTC TAG ACC TAG GGA GCT CAG
Xba I Sal I Pst I Pae I Hind III
TAG AGT CGA CCT GCA GGC ATG CAA GCT TGG CGT AAT CAT GGT CAT AGC TGT TTC CTG -3’
ATC TCA GCT GGA CGT CCG TAC GTT CGA ACC GCA TTA GTA CCA GTA TCG ACA AAG GAC -5’
Lac Z
M13/pUC Reverse Primer (-26)
Sangon Biotech
3. pUCm-T載體的酶切位點(diǎn)
a. 不切割 pUCm-T 載體的限制性內(nèi)切酶
AcaI,AccIII,AceII,Afa24RI,AgeI,AmaI,AosIII,ApaI,ApeI,AscI,Asp78I,AtuCI,AvaIII,AvrII,BaeI,BalI,Bbf7411I,BbsI,BclI,Bco102I
I,BfrBI,BlpI,BmgI,BplI,Bpu10I,Bpu1268I,BsaAI,BsaFI,BsaKI,BsaMI,BscEI,BscJI,Bse59I,BseRI,BsgI,BsiWI,BsmFI,BsmGI,B
sp120I,Bsp87I,BspGI,BspLU11III,BsrGI,BssHII,Bst1107I,Bst29I,Bst98I,BstEII,BstXI,Bsu36I,CfrAI,CspI,Csp45I,DraIII,DrdII,
EciAI,EciEI,Eco47III,Eco72I,EcoAI,EcoBI,EcoDI,EcoDXXI,EcoDR3,EcoEI,EcoNI,EcoR124I,EcoR124II,EcoRD3,FinI,FseI,
HpaI,MluI,Mlu1106I,Mlu113I,Msp20I,MunI,NaeI,NgoMI,NheI,NruI,NsiI,PacI,PauI,PfuI,PmeI,Ppu10I,Ppu6I,PpuMI,PshAI,Rle
AI,SacII,SanDI,SfiI,SgfI,SgrAI,SmaI,SnaI,SnaBI,SpeI,SrfI,Sse8647I,StuI,StySQ,SwaI,Uba1220I,Uba1221I,Uba1382I,UbaD
I,Van91I,XmaI
b. 切割 pUCm-T 載體一次的限制性內(nèi)切酶
497AacI,2708AatII,517AccI,408Acc65I,503AcrI,515Acs1371I,893AflIII,2263AflIV,503AhyAI,1309AlwNI,186ApaBI,396ApoI,
443Apu16I,533Asp52I,527Asp5HI,455AteI,504AvaI,498BamHI,406BanII,239BbeI,234BbeAI,534BbrI,2291BcgI,2325BcgI'
492Bco63I,492BglII,1852Bli49I,1847BsaI,756BsaXI,497BsaBI,117BsbI,449BshLI,462BsoDI,401Bsp117I,407BspJ106I,893
BspLU11I,529BspMI,455Bst224I,1866Cfr10I,515ChuII,445ClaI,456DsaI,515DsaVI,401Ecl137I,1786EclHKI,463Eco52I,39
5Eco82I,397EcoDR2,404EcoICRI,2443EcoKI,2762EcoO109I,396EcoRI,452EcoRV,541EcoprrI,237EheI,50Esp16I,45Esp3
I,474FsuI,518HincII,534HindIII,235KasI,412KpnI,236NarI,456NcoI,508Nli387/7I,463NotI,1801Pfl1108I,2703Ppu1253I,276
5PssI,406SacI,516SalI,777SapI,2266ScaI,506SciI,476SexAI,532SphI,526Sse8387I,2590SspI,456StyI,158StySJ,2443Sty
SPI,2380SynII,478Tth111I,1490Tth111II,2760Uba1326,510XbaI,484XcmI,504XhoI,2385XmnI.
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