長(zhǎng)片段 PCR 擴(kuò)增試劑盒
產(chǎn)品編號(hào)： B639285
包裝規(guī)格： 50 rnx/ 100 rnx
試劑盒組成
組分 50 rnx 100 rnx
10X Long PCR Buffer 0.5 ml 1 ml
25 mM MgSO4 Solution 0.5 ml 1 ml
10 mM dNTP Mix 0.06 ml 0.12 ml
Dimethyl sulfoxide (DMSO) 0.25 ml 0.5 ml
Long and Accurate Enzyme, 5 U/µl 25 µl (125 U) 50 µl (250 U)
Sterilized ddH2O 1 ml 2 ml
操作手冊(cè) 1 1
保存方法及穩(wěn)定性
4°C 運(yùn)輸， -20°C 保存。避免反復(fù)凍融。
產(chǎn)品介紹
Long and Accurate PCR Kit 用于擴(kuò)增大于或等于 5 kb 的片段。試劑盒中最重要的組分是 Long and Accurate Enzyme，
由 Taq DNA 酶和具有校對(duì)活性的熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶組合而成。這種酶的主要特點(diǎn)包括兩方面，一個(gè)是使用人類基因組 DNA
模板時(shí)產(chǎn)物可達(dá) 20 kb，使用病毒基因組模板時(shí)產(chǎn)物可達(dá) 40 kb；另一個(gè)是比 Taq DNA 聚合酶保真性高。Long PCR Buffer
可保護(hù) DNA 在長(zhǎng)期熱循環(huán)中免受損傷。
10xLong PCR Buffer 含有 20 mM MgSO4，在反應(yīng)體系中 MgSO4 終濃度為 2 mM MgSO4。如果需要更高濃度的 Mg2+，
請(qǐng)用 long and accurate PCR kit 提供的 25 mM MgSO4 溶液調(diào)整 Mg2+濃度。
標(biāo)準(zhǔn)操作步驟
1. 模板DNA
在 50 µl 反應(yīng)體系中使用 1~10 ng 的質(zhì)�；蚴删w DNA，或 0.1~1 µg 的基因組 DNA。高質(zhì)量和完整的模板 DNA 是長(zhǎng)
片段 PCR 擴(kuò)增的關(guān)鍵。損傷的 DNA 可能會(huì)得不到目的 PCR 產(chǎn)物�；蚪M DNA 可通過磁珠法 DNA 抽提試劑盒獲得，無需
離心過程。另外，請(qǐng)將模板 DNA 分裝成小分存儲(chǔ)，避免反復(fù)凍融。降解的模板 DNA 不適合用來擴(kuò)增長(zhǎng)的目的片度。
2. 引物濃度
在一次 PCR 中引物的終濃度大約為 0.1~0.5 µM。PCR 產(chǎn)物小于或等于 10 kb 時(shí)，引物的終濃度為 0.1 µM。長(zhǎng)片段的引
物設(shè)計(jì)原則和普通引物設(shè)計(jì)原則相似。主要不同在于引物應(yīng)為 28~35 個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
3. 冰上溶解各組分并短暫離心。
4. 根據(jù)以下實(shí)驗(yàn)方案準(zhǔn)備反應(yīng)體系：
10X Long PCR Buffer 5 µl
10 mM dNTP Mix 1 µl
Forward primer 0.1~0.5 µM
Sangon Biotech
Reverse primer 0.1~0.5 µM
Template DNA 1 ng~1 µg
Long and Accurate Enzyme 1.25~2.5 U
Sterilized ddH2O 補(bǔ)足至 50 µl
注意：
如果 PCR 產(chǎn)物 GC 含量高，請(qǐng)加入 2 µl DMSO 到 50 µl PCR 反應(yīng)體系中；
如果 PCR 產(chǎn)物大于 20 kb，dNTP Mix 終濃度是 0.3 mM；
請(qǐng)?jiān)谧詈蠹尤?Long and Accurate Enzyme 并直接開始 PCR。
PCR 產(chǎn)物小于等于 15 kb，則 50 µl 使用 1.25 U long and accurate enzyme；PCR 產(chǎn)物大于>15 kb，每 50 µl 使用量最多為
2.5 U。
5. 將反應(yīng)管放入離心機(jī)，離心30-60 s；
6. 若使用的熱循環(huán)儀無熱蓋功能，則用礦物油將PCR混合液覆蓋。
7. 樣品放入PCR儀中，并根據(jù)以下循環(huán)程序直接開始PCR。
步驟 溫度，°C 時(shí)間 循環(huán)數(shù)
預(yù)變性 94 2 min 1
變性 94 20 s
退火 Tm-5 30 s 10
延伸 68 1 min/kb
變性 94 20 s
退火 Tm 20~25 -5 30 s
延伸 68 1min/kb+X s/cycle
終延伸 68 10 min 1
保存 4 N.A. N.A.
根據(jù)下表計(jì)算延伸時(shí)間：
PCR 片段長(zhǎng)度，kb 10 15 20 25 30 35 40
延伸時(shí)間，min 8 15 20 20 23 25 27
每個(gè)循環(huán)需要增加的時(shí)間，X s/cycle 5 5 10 10 15 15 20
應(yīng)用案例
1. 擴(kuò)增Enterobacteriaλ噬菌體基因組DNA區(qū)域(20kb)
2. 根據(jù)以下實(shí)驗(yàn)方案準(zhǔn)備反應(yīng)體系：
10xLong PCR Buffer 5 µl
dNTP Mix (10 mM) 1 µl
Lambda 20kF (10 µM) 0.5 µl
Lambda 20kR (10 µM) 0.5 µl
Lambda DNA (2 ng/µl) 0.5 µl
Long and Accurate Enzyme 0.25 µl
Sangon Biotech
Sterilized ddH2O 補(bǔ)足至 50 µl
3. 將反應(yīng)管放入離心機(jī)并離心30–60 s。
4. 將樣品放入循環(huán)儀中并根據(jù)下列循環(huán)程序直接開始PCR。
步驟 溫度°C 時(shí)間 循環(huán)次數(shù)
Initial Denaturation 94 2 min 1
Denaturation 94 20 s
Annealing 63 30 s 10
Extension 68 20 min
Denaturation 94 20 s
Annea 20 ling 63 30 s
Extension 68 20 min+10 s/cycle
Final Extension 68 10 min 1
Hold 4 N.A. N.A.
5. PCR 產(chǎn)物通過0.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示（圖1）
M: Marker SM0101;
1: lambda 20kb
圖 1 20kb PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳
常見問題指南
可能原因 意見& 建議
產(chǎn)物少或沒有
模板 DNA 不足 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作步驟提高 PCR 中模板 DNA 的含量。
模板質(zhì)量差
始終使用純化、完整的高質(zhì)量 DNA 作為模板。用瓊脂糖凝膠電泳分析模板的
完整性。將模板 DNA 分裝儲(chǔ)存，避免反復(fù)凍融。
困難模板
如果模板 DNA 的 GC 含量高，反應(yīng)體系中加入 4% DMSO 將有助于反應(yīng)。此
外，每 50 μl PCR 反應(yīng)體系中建議使用高達(dá) 2.5 U 的酶濃度。
熱循環(huán)相關(guān)問題 檢查是否正確設(shè)置了熱循環(huán)程序，以 5 個(gè)循環(huán)數(shù)為增量提高循環(huán)次數(shù)。
Sangon Biotech
可能原因 意見& 建議
引物濃度過低 使用引物終濃度為 0.1~0.5 μM。
Mg2+濃度不是最優(yōu) 優(yōu)化并調(diào)整 Mg2+濃度。
產(chǎn)物多條帶
引物設(shè)計(jì)不完善 檢查引物設(shè)計(jì)及其特異性。
引物降解 檢查引物溶液濃度和質(zhì)量。
退火溫度過低 提高退火溫度。進(jìn)行梯度 PCR，找到最優(yōu)的退火溫度。
循環(huán)數(shù)太多 減少循環(huán)次數(shù)以排除非特異性產(chǎn)物。
模板太多
擴(kuò)增病毒或質(zhì)粒 DNA 時(shí)，每 50 μl PCR 體系的初始模板濃度不應(yīng)超過 10 ng；
擴(kuò)增基因組 DNA 時(shí)，每 50 μl PCR 體系的初始模板濃度不應(yīng)超過 1 μg。
產(chǎn)物被污染
起始模板太多 減少模板 DNA 的量。
循環(huán)數(shù)太多 以 5 個(gè)循環(huán)數(shù)為增量減少循環(huán)次數(shù)
延伸時(shí)間過長(zhǎng) 以 2 分鐘為增量減少延伸時(shí)間
Mg2+ 濃度不是最優(yōu) 優(yōu)化并調(diào)整 Mg2+濃度
酶過量 確保每 50 μl PCR 體系中加入的酶含量等于或少于 2.5 U。
攜帶污染 純化 DNA 模板。使用尿嘧啶 DNA 糖基化酶以防止攜帶污染。
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