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溶血隱秘桿菌染料法熒光定量PCR試劑盒

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 溶血隱秘桿菌染料法熒光定量PCR試劑盒具有下列特點(diǎn):

1.即開即用,用戶只需要提供 DNA 模板。

2.引物根據(jù) EB 病毒專一區(qū)設(shè)計(jì),特異性高。

3.熒光定量PCR 檢測(cè),比常規(guī) PCR 更加靈敏。

4.一管式閉管操作,降低了交叉污染。

5.本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR。

本產(chǎn)品只適用于科研,不能用于臨床診斷

 

成分

十孔盒包裝

qPCR Magic Mix

500 μL棕色管

熒光PCR 專用模板稀釋液

1 mL(黃蓋

病毒染料法 qPCR 引物混合液

100 μL(白蓋)

病毒染料法 qPCR 陽性對(duì)照

(1×10E8 拷貝/μL)

50 μL黃蓋

使用手冊(cè)

1 份

運(yùn)輸及保存:低溫運(yùn)輸、-20℃保存,有效期一年。

自備試劑:DNA 模板、超純水、10×ROX(根據(jù)機(jī)型決定,具體見使用方法)。

使用方法 一、稀釋 PCR 陽性對(duì)照(以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 個(gè) 10 倍稀釋度為例)

1. 注意:由于陽性對(duì)照濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照,只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽性對(duì)照。

2. 標(biāo)記 個(gè)離心管,分別為 76,5,43,2。

3.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液(最好用帶芯槍頭,下同)。

4.在 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對(duì)照,充分震蕩 分鐘,得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。

5.換槍頭,在 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得),

充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。

6.換槍頭,在 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照到 號(hào)管中,充分震蕩 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。

7.重復(fù)上面的操作直到得到 個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。放冰上待用。二、樣品 DNA 的制備

8.如果有 個(gè)樣品,必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取,多出的一個(gè)是 PC(樣品制備陽性對(duì)照),

一個(gè)是 NC(樣品制備陰性對(duì)照)。可以用 10μL PCR 陽性對(duì)照的 10000 倍稀釋的(稀釋后濃度為 1×10E4 拷貝/μL10μL 相當(dāng)于 萬拷貝,可以將 10μL 原液加入到 990μL 自備 TE 溶液中,充分混勻,此為 100 倍稀釋液。再取 10μL 此稀釋液加入到 990μL 自備 TE 溶液中,充分混勻,此為 10000 倍稀釋液)再加上一定量的水作為制備的陽性對(duì)照(加水后其總體積跟樣品一樣,樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求)?梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫(duì)照。制備所得成為樣品 DNA。

9.用自選方法純化 N+2 個(gè)樣品的 DNA,本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)核酸提取試劑盒兼容。

三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)(20 μL 體系,在樣品制備室進(jìn)行)

10.如果做定量分析并且只做 次重復(fù),則標(biāo)記 N+9 個(gè)PCR 管,其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照,個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析,并且只做 次重復(fù),則標(biāo)記 N+4 個(gè)PCR 管,其中 N+2 個(gè)用于上步得到的N+2 個(gè)樣品,個(gè)用于PCR 陰性對(duì)照(用水做模板),個(gè)用于PCR 陽性對(duì)照(用第 號(hào)陽性對(duì)照稀釋液,濃度為 14810 拷貝/μL)。下面只描述定量分析的步驟, 定性分析只是把 個(gè)標(biāo)曲反應(yīng)縮減成 個(gè),其余不變。

11.在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢

后才設(shè)置陽性對(duì)照,并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后最后加)

成分

樣品管

N+2 個(gè)

PCR 陰性

對(duì)照管

PCR 陽性

對(duì)照管(2-7 管)

2×qPCR MagicMix

10 μL

10 μL

各 10 μL

染料法qPCR 引物混

合液

2 μL

2 μL

 2 μL

自備 10×ROX (見注)

2 μL

2 μL

 2 μL

N+2 待測(cè)樣品 cDNA 模板

6 μL

-

-

自備超純水

-

6

-

第 7 步所得 PCR 陽性對(duì)照稀釋液(2-7 號(hào)

 

-

 

-

 6μL2 號(hào)樣到

2 號(hào)管,3 號(hào)樣到 3

號(hào)管…)

:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用ROX 作為對(duì)照,其他熒光 PCR 儀器(如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480)不需要使用 ROX,則用水替代。

12. 蓋上蓋子后上機(jī),按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR(具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化)。

 

四、數(shù)據(jù)處理

13.如果把溶血隱秘桿菌染料法熒光定量PCR試劑盒用于定量檢測(cè),則以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸,

以 Ct 值為縱軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 cDNA 濃度的log 值,再推算出其濃度。

14.如果把本試劑盒用于定性檢測(cè),只判斷陽性或陰性,則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 36。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長,有典型擴(kuò)增曲線,Ct 值應(yīng)該小于或等于30。對(duì)待測(cè)樣品,如果其 Ct 大于或等于 34 則為陰性,如果小于或等于 30 則為陽性。如果在 30-34 之間,則重復(fù)一次。若重復(fù)結(jié)果 Ct 值小于 34,擴(kuò)增曲線有明顯起峰,該樣本判斷為陽性,否則為陰性

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