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pCMV-AT1.03 (ATP熒光探針)

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 pCMV-AT1.03 (ATP熒光探針)是自行研發(fā)的含有CMV啟動子用于在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)AT1.03蛋白以作為ATP熒光探針的工具質(zhì)粒。本質(zhì)粒表達(dá)的ATP熒光探針被稱為ATeam,即基于FoF1-ATP合成酶ε亞基的ATP指示劑(Adenosine 5'-Triphosphate indicator based on Epsilon subunit for Analytical Measurements)。AT1.03是一種低親和力的ATeam (Kd=3.3mM at 37℃),可以檢測毫摩爾級的ATP水平。pCMV-AT1.03質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞后,AT1.03蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)中,適合用于實時監(jiān)控細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的ATP濃度變化。

AT1.03蛋白是以熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)為基礎(chǔ)的實時監(jiān)測單個活細(xì)胞內(nèi)的ATP水平及其實時變化的ATP熒光探針。該熒光探針由N端的青色熒光蛋白(cyan fluorescent protein) mseCFPΔC11 (激發(fā)光波長435nm,發(fā)射光波長475nm)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的FoF1-ATP合成酶的ε亞基以及C端的黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein) cp173-mVenus (激發(fā)光波長515nm,發(fā)射光波長527nm)融合而成(參考圖1)?莶菅挎邨U菌的FoF1-ATP合成酶的ε亞基是幾乎最小的ATP結(jié)合蛋白(14kDa),它由一個N端β桶狀結(jié)構(gòu)域和兩個C端α螺旋結(jié)構(gòu)域組成。作為基于FRET的ATP熒光探針,F(xiàn)oF1-ATP合成酶的ε亞基具有幾個突出優(yōu)點:ε亞基與ATP結(jié)合,但不水解ATP;結(jié)合ATP,但不結(jié)合ADP、GTP、CTP以及UTP;當(dāng)ATP結(jié)合時,ε亞基發(fā)生很大的構(gòu)象變化形成一個折疊的構(gòu)象(folded form),從而使N端的青色熒光蛋白以及C端的黃色熒光蛋白得以在空間上接近,而發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(激發(fā)光波長435nm,發(fā)射光波長527nm)。

圖1.AT1.03蛋白結(jié)構(gòu)圖。

pCMV-AT1.03質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后的ATP熒光探針表達(dá)效果請參考圖2。

圖2.pCMV-AT1.03質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后的ATP熒光探針表達(dá)效果圖。A圖為明場照片,B圖為熒光照片。

AT1.03的熒光信號在pH7.1-8.5之間非常穩(wěn)定,這樣AT1.03的熒光信號在正常細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(pH7.3左右)幾乎不會發(fā)生波動。ATP的結(jié)合常數(shù)Kon為1.7×10-2mM-1s-1,ATP的解離常數(shù)Koff為9.8×10-2s-1,因此AT1.03可用于監(jiān)控細(xì)胞內(nèi)高達(dá)0.1s-1 ATP的動態(tài)變化,特別適合用于實時監(jiān)測超短時間內(nèi)的ATP濃度變化。

pCMV-AT1.03 (ATP熒光探針)為卡那霉素抗性,轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,可使用G418篩選穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株。

pCMV-AT1.03質(zhì)粒的主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
CMV promoter 1–602
T3 promoter and T3 primer binding site 620–639
AT1.03 699-2534
multiple cloning site 651-692/2535-2558
T7 promoter and T7 primer binding site 2581–2629
SV40 polyA signal 2641–3024
f1 origin of ss-DNA replication 3162–3466
bla promoter 3491–3615
SV40 promoter 3635–3973
neomycin/kanamycin resistance ORF 4008–4799
HSV-thymidine kinase (TK) polyA signal 4800–5258
pUC origin 5387–6054

pCMV-AT1.03質(zhì)粒(6106bp)的圖譜如下:

 

pCMV-AT1.03中沒有的酶切位點(Restriction enzymes that do not cut pCMV-AT1.03)包括:

AclI AfeI AflII AgeI AhdI AscI AsiSI
BaeI BbsI BbvCI BlpI BsiWI BsmBI BspEI
BspQI BssHII BstEII BstZ17I EarI EcoNI Esp3I
FseI HindIII NruI PflMI PmeI PmlI PpuMI
PshAI PspXI SalI SapI SbfI ScaI SgrAI
SwaI XcmI XmnI        

pCMV-AT1.03中的單酶切位點(Restriction enzymes that cut pCMV-AT1.03)包括:

AccI GT`MK,AC 1432 NarI GG`CG,CC 4136
ApaLI G`TGCA,C 5740 NdeI CA`TA,TG 240
BamHI G`GATC,C 687 NheI G`CTAG,C 597
BclI T`GATC,A 2795 NotI GC`GGCC,GC 672
BglII A`GATC,T 2535 PaeR7I C`TCGA,G 2541
BmgBI CAC|GTC 1772 PciI A`CATG,T 6054
BmtI G,CTAG`C   597 PflFI GACN`N,NGTC   4254
BsaI GGTCTCN`NNNN,   5125 PluTI G,GCGC`C 4135
BsaXI ,NNN`(N)9AC(N)5CTCC(N)7,NNN` 3185 PvuI CG,AT`CG 2639
BsrDI GCAATG,NN` 4367 RsrII CG`GWC,CG 4652
BsrGI T`GTAC,A 1990 SacI G,AGCT`C 651
BstBI TT`CG,AA 4818 SacII CC,GC`GG 660
BstXI CCAN,NNNN`NTGG   663 SfiI GGCCN,NNN`NGGCC   3908
CspCI ,NN`(N)11CAA(N)5GTGG(N)10,NN` 380 SfoI GGC|GCC 4137
DraIII CAC,NNN`GTG 3251 SmaI CCC|GGG 682
Eco53kI GAG|CTC 653 SnaBI TAC|GTA 346
EcoRI G`AATT,C 1791 SpeI A`CTAG,T 2553
EcoRV GAT|ATC 1445 SrfI GCCC|GGGC 682
HincII GTY|RAC 2901 StuI AGG|CCT 3957
HpaI GTT|AAC 2901 TspMI C`CCGG,G 680
KasI G`GCGC,C 4135 Tth111I GACN`N,NGTC 4254
MfeI C`AATT,G 2888 XbaI T`CTAG,A 2547
MluI A`CGCG,T 3024 XhoI C`TCGA,G 2541
MscI TGG|CCA 4218 XmaI C`CCGG,G 680

如需對pCMV-AT1.03質(zhì)粒中插入片段AT1.03進行測序時,推薦使用的正向測序引物T3和反向測序引物T7的序列如下:

T3 primer (620-639): 5' AATTAACCCTCACTAAAGGG 3'

T7 primer (2581–2629): 5' GTAATACGACTCACTATAGGGC 3'

包裝清單:

產(chǎn)品規(guī)格 產(chǎn)品名稱 包裝
1μg pCMV-AT1.03 (ATP熒光探針) 1μg
100μg pCMV-AT1.03 (ATP熒光探針) 100μg
說明書 1份

保存條件:

-20℃保存。

注意事項:

本質(zhì)粒未經(jīng)書面許可不得用于任何商業(yè)用途,也不得移交給訂貨人所在實驗室外的任何個人或單位。

本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品,不得存放于普通住宅內(nèi)。

為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明:
1.首次使用1µg包裝的本產(chǎn)品時,請先取少量本質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌,進行質(zhì)粒小量、中量或大量抽提后再用于后續(xù)用途。抽提獲得的質(zhì)粒可以通過酶切電泳進行鑒定,或通過測序進行鑒定。
2.100µg包裝的本產(chǎn)品質(zhì)粒濃度為0.1µg/µl,共1ml。可以直接用于酶切或者轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

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