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pCMV-Mito-AT1.03 (線粒體ATP熒光探針)

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pCMV-Mito-AT1.03 (線粒體ATP熒光探針)是自行研發(fā)的含有CMV啟動子用于在哺乳動物線粒體中表達(dá)帶有線粒體定位信號(Mitochondrial localization signal, MLS)的AT1.03蛋白以作為細(xì)胞核ATP熒光探針的工具質(zhì)粒。本質(zhì)粒表達(dá)的ATP熒光探針被稱為ATeam,即基于FoF1-ATP合成酶ε亞基的ATP指示劑(Adenosine 5'-Triphosphate indicator based on Epsilon subunit for Analytical Measurements)。AT1.03是一種低親和力的ATeam (Kd=3.3mM at 37℃),可以檢測毫摩爾級的ATP水平。pCMV-Mito-AT1.03質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞后,AT1.03蛋白由于帶有線粒體定位信號主要分布在線粒體中,適合用于實(shí)時監(jiān)控線粒體內(nèi)的ATP濃度變化。

pCMV-Mito-AT1.03 (線粒體ATP熒光探針)也可以用作線粒體熒光探針,在活細(xì)胞中或細(xì)胞固定后標(biāo)記線粒體的位置和形態(tài)。

AT1.03蛋白是以熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)為基礎(chǔ)的實(shí)時監(jiān)測單個活細(xì)胞內(nèi)的ATP水平及其實(shí)時變化的ATP熒光探針。帶有線粒體定位信號的該熒光探針由N端的青色熒光蛋白(cyan fluorescent protein) mseCFPΔC11 (激發(fā)光波長435nm,發(fā)射光波長475nm)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的FoF1-ATP合成酶的ε亞基以及C端的黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein) cp173-mVenus (激發(fā)光波長515nm,發(fā)射光波長527nm)融合而成(參考圖1)?莶菅挎邨U菌的FoF1-ATP合成酶的ε亞基是幾乎最小的ATP結(jié)合蛋白(14kDa),它由一個N端β桶狀結(jié)構(gòu)域和兩個C端α螺旋結(jié)構(gòu)域組成。作為基于FRET的ATP熒光探針,F(xiàn)oF1-ATP合成酶的ε亞基具有幾個突出優(yōu)點(diǎn):ε亞基與ATP結(jié)合,但不水解ATP;結(jié)合ATP,但不結(jié)合ADP、GTP、CTP以及UTP;當(dāng)ATP結(jié)合時,ε亞基發(fā)生很大的構(gòu)象變化形成一個折疊的構(gòu)象(folded form),從而使N端的青色熒光蛋白以及C端的黃色熒光蛋白得以在空間上接近,而發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(激發(fā)光波長435nm,發(fā)射光波長527nm)。帶有線粒體定位信號的AT1.03蛋白和不帶有線粒體定位信號的AT1.03蛋白相比,完全保留了AT1.03蛋白的以FRET為基礎(chǔ)的ATP熒光探針的功能。

圖1.Mito-AT1.03蛋白結(jié)構(gòu)圖,N端融合了線粒體靶向信號(細(xì)胞色素c氧化酶VIII雙鏈體)。Cox x2為線粒體定位信號。

pCMV-Mito-AT1.03質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后的ATP熒光探針表達(dá)效果請參考圖2。

圖2.pCMV-Mito-AT1.03質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后的ATP熒光探針表達(dá)效果圖。A圖為明場照片,B圖為熒光照片。

AT1.03的熒光信號在pH7.1-8.5之間非常穩(wěn)定,這樣AT1.03的熒光信號在正常細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(pH7.3左右)幾乎不會發(fā)生波動。ATP的結(jié)合常數(shù)Kon為1.7×10-2mM-1s-1,ATP的解離常數(shù)Koff為9.8×10-2s-1,因此AT1.03可用于監(jiān)控細(xì)胞內(nèi)高達(dá)0.1s-1 ATP的動態(tài)變化,特別適合用于實(shí)時監(jiān)測超短時間內(nèi)的ATP濃度變化。帶有線粒體定位信號的AT1.03蛋白和不帶有線粒體定位信號的AT1.03蛋白相比,pH穩(wěn)定性、結(jié)合常數(shù)、解離常數(shù)等性能基本一致。

本質(zhì)粒為卡那霉素抗性,轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,可使用G418篩選穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株。

pCMV-Mito-AT1.03質(zhì)粒的主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
CMV promoter 1–602
T3 promoter and T3 primer binding site 620–639
Mito-AT1.03 699-2702
multiple cloning site 651-692/2703-2726
T7 promoter and T7 primer binding site 2749–2797
SV40 polyA signal 2809–3192
f1 origin of ss-DNA replication 3330–3634
bla promoter 3659–3783
SV40 promoter 3803–4141
neomycin/kanamycin resistance ORF 4176–4967
HSV-thymidine kinase (TK) polyA signal 4968–5426
pUC origin 5555–6222

pCMV-Mito-AT1.03質(zhì)粒(6274bp)的圖譜如下:

 

pCMV-Mito-AT1.03中沒有的酶切位點(diǎn)(Restriction enzymes that do not cut pCMV-Mito-AT1.03)包括:

AclI AfeI AflII AgeI AhdI AscI AsiSI
BaeI BbsI BbvCI BlpI BsiWI BsmBI BspEI
BspQI BstEII BstZ17I EarI EcoNI Esp3I FseI
HindIII NruI PmeI PmlI PpuMI PshAI PspXI
SalI SapI SbfI ScaI SgrAI SwaI XcmI
XmnI            

pCMV-Mito-AT1.03中的單酶切位點(diǎn)(Restriction enzymes that cut pCMV-Mito-AT1.03)包括:

AccI GT`MK,AC 1600 NdeI CA`TA,TG 240
ApaLI G`TGCA,C 5908 NheI G`CTAG,C 597
BamHI G`GATC,C 687 NotI GC`GGCC,GC 668
BclI T`GATC,A 2963 PaeR7I C`TCGA,G 2709
BglII A`GATC,T 2703 PciI A`CATG,T 6222
BmgBI CAC|GTC 1940 PflFI GACN`N,NGTC 4422
BmtI G,CTAG`C 597 PflMI CCAN,NNN`NTGG 863
BsaI GGTCTCN`NNNN, 5293 PluTI G,GCGC`C 4303
BsaXI ,NNN`(N)9AC(N)5CTCC(N)7,NNN` 3353 PvuI CG,AT`CG 2807
BsrDI GCAATG,NN` 4535 RsrII CG`GWC,CG 4820
BsrGI T`GTAC,A 2158 SacI G,AGCT`C 651
BstBI TT`CG,AA 4986 SacII CC,GC`GG 660
BstXI CCAN,NNNN`NTGG 663 SfiI GGCCN,NNN`NGGCC 4076
CspCI ,NN`(N)11CAA(N)5GTGG(N)10,NN` 380 SfoI GGC|GCC 4305
DraIII CAC,NNN`GTG 3419 SmaI CCC|GGG 682
Eco53kI GAG|CTC 653 SnaBI TAC|GTA 346
EcoRI G`AATT,C 1959 SpeI A`CTAG,T 2721
EcoRV GAT|ATC 1613 SrfI GCCC|GGGC 682
HincII GTY|RAC 3069 StuI AGG|CCT 4125
HpaI GTT|AAC 3069 TspMI C`CCGG,G 680
KasI G`GCGC,C 4303 Tth111I GACN`N,NGTC 4422
MfeI C`AATT,G 3056 XbaI T`CTAG,A 2715
MluI A`CGCG,T 3192 XhoI C`TCGA,G 2709
MscI TGG|CCA 4386 XmaI C`CCGG,G 680
NarI GG`CG,CC 4304      

如需對pCMV-Mito-AT1.03質(zhì)粒中插入片段Mito-AT1.03進(jìn)行測序時,推薦使用的正向測序引物T3和反向測序引物T7的序列如下:

T3 primer (620-639): 5' AATTAACCCTCACTAAAGGG 3'

T7 primer (2749–2797): 5' GTAATACGACTCACTATAGGGC 3'

包裝清單:

產(chǎn)品編號 產(chǎn)品名稱 包裝
D2606-1μg pCMV-Mito-AT1.03 (線粒體ATP熒光探針) 1μg
D2606-100μg pCMV-Mito-AT1.03 (線粒體ATP熒光探針) 100μg
說明書 1份

保存條件:

-20℃保存。

注意事項(xiàng):

本質(zhì)粒未經(jīng)書面許可不得用于任何商業(yè)用途,也不得移交給訂貨人所在實(shí)驗(yàn)室外的任何個人或單位。

本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品,不得存放于普通住宅內(nèi)。

為了您的安全和健康,請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說明:
1.首次使用1µg包裝的本產(chǎn)品時,請先取少量本質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌,進(jìn)行質(zhì)粒小量、中量或大量抽提后再用于后續(xù)用途。抽提獲得的質(zhì)?梢酝ㄟ^酶切電泳進(jìn)行鑒定,或通過測序進(jìn)行鑒定。
2.100µg包裝的本產(chǎn)品質(zhì)粒濃度為0.1µg/µl,共1ml?梢灾苯佑糜诿盖谢蛘咿D(zhuǎn)染細(xì)胞。

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