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過氧化氫酶(CAT)試劑盒(鉬酸銨比色法)

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測定意義:                           

CAT(EC 1.11.1.6)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中,是最主要的H2O2清除酶,在活性氧清除系統(tǒng)中具有重要作用。

測定原理:

過氧化氫能氧化MoO42-MoO52-,MoO52-接受氫氧根的電子成鍵,分子間立即脫水縮合,得到穩(wěn)定的黃色復合物(H2MoO4·XH2O)n405nm處有強烈吸收峰,其吸光值和過氧化氫濃度成線性關(guān)系。測定出體系剩余過氧化氫在405nm的吸光值即可反映CAT的催化活性。

需自備的儀器和用品:

酶標儀、臺式離心機、可調(diào)式移液器、96孔板、研缽、冰蒸餾水 

試劑組成和配制:

提取液:液體100 mL×1瓶,4℃保存;

試劑一液體10 mL×1瓶,4℃避光保存;

試劑二:液體25 mL×1,常溫保存;

試劑三:液體60 mL×1,4℃保存;

粗酶液提。

1、細菌、細胞或組織樣品的制備:

細菌或培養(yǎng)細胞:先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細菌或細胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液,超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

組織:按照組織質(zhì)量(g:提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

2血清(漿)樣品:直接檢測。

測定步驟:

1、 酶標儀預熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至405 nm

2、EP管中加入下列試劑

試劑名稱(μL

測定管

空白

樣本

10

 

試劑一

60

 

混勻,25℃準確反應2 min

試劑二

200

 

試劑三

530

530

試劑二

 

200

提取液

 

10

試劑一

 

60

混勻,200μL96孔板立即測定A空白A測定,ΔA=A空白-A測定。空白管只需做一管。

 CAT活性計算:

1標準曲線:y = 0.09x + 0.0013      R2 = 1      x:體系中過氧化氫濃度變化值(μmol/mL

                                          y:吸光值差值ΔA

2、血清(漿)CAT活力的計算:

單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘催化1μmol H2O2降解定義為一個酶活力單位。

CAT(μmol /min/mL)= =(ΔA-0.0013)÷0.09×V反總÷V÷T

                    =444.44×(ΔA-0.0013)

3、組織、細菌或細胞中CAT活力計算:

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化1μmol H2O2降解定義為一個酶活力單位。

CAT(μmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0013)÷0.09×V反總÷(V×Cpr) ÷T

                    =444.44×(ΔA-0.0013)÷Cpr

2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘催化1μmol H2O2降解定義為一個酶活力單位。

CAT(μmol/min/g 鮮重)=(ΔA-0.0013)÷0.09×V÷W× V÷V樣總)÷T

                    =444.44×(ΔA-0.0013)÷W

V反總:反應體系總體積,0.8 mL;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,2 min;W:樣質(zhì)量,g;Cpr樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL。

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