注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義
植物細(xì)胞壁中的果膠是植物初生細(xì)胞壁的主要成分，除了起結(jié)構(gòu)支撐、物質(zhì)運(yùn)輸?shù)茸饔猛猓�具有抵抗逆
境的作用。果膠甲酯化程度影響了細(xì)胞壁的堅(jiān)韌程度及其抗性。
測(cè)定原理
果膠甲酯鍵經(jīng)皂化處理后釋放出甲醇，甲醇與 2,4-戊二酮反應(yīng)顯色，在 412nm 下測(cè)定吸光值；同時(shí)半乳糖
醛酸在 70℃下與濃硫酸反應(yīng)生成 5-甲�；�-2-呋喃甲酸，5-甲�；�-2-呋喃甲酸與 3,5-二甲基苯酚反應(yīng)產(chǎn)生有
色物質(zhì)，在 450nm 下有最大吸光值。以甲醇生成量與半乳糖醛酸含量的比值代表果膠甲酯化程度。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器
天平、低溫離心機(jī)、酶標(biāo)儀、96 孔板、恒溫水浴鍋、蒸餾水、硫酸。
試劑組成和配制
提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。
試劑一：液體 3mL×1 瓶，4℃保存。
試劑二：液體 3mL×1 瓶，4℃保存。
試劑三：液體 3mL×1 瓶，4℃避光保存。
試劑四：液體 2.5mL×1 瓶，4℃避光保存。
試劑五：粉劑×1 瓶，4℃避光保存；臨用前加入 22mL 試劑六充分溶解待用，用不完的試劑 4℃避光保存。
試劑六：液體 25mL×1 瓶，4℃保存。
試劑七：液體 3mL×1 瓶，4℃保存。
試劑八：液體 2.5mL×1 瓶，4℃避光保存。
酶液提取
稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1mL 蒸餾水，進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心 10min，棄上清，留沉淀。沉淀中加
入 1mL 提取液，混勻后 90℃水浴 2h，冷卻至室溫，10000g4℃離心 10min，取上清待測(cè)。
測(cè)定操作表
1.甲醇生成量測(cè)定
試劑名稱(chēng)（μL）
空白管
測(cè)定管
樣本
50
提取液
50
試劑一
25
25
混勻，室溫靜置 30min
試劑二
25
25
試劑三
20
20
混勻，冰浴至紫色褪去，約需要 15-30min
試劑四
20
20
水
60
60
混勻，室溫反應(yīng) 1h
試劑五
200
200
混勻，60℃反應(yīng) 15min。取 200μL 加入 96 孔板，測(cè)定 412nm 下吸光值 A
測(cè)定與 A 空白�！�A1=A 測(cè)定-A 空白
2. 半乳糖醛酸含量測(cè)定
試劑名稱(chēng)（μL）
測(cè)定管
樣本
25
試劑七
25
濃硫酸
400
70℃水浴 10min，冷卻至室溫
試劑八
20
充分混勻，靜置 10min 后取 200μL 于 96 孔板測(cè)定 450nm 處吸光值 A1 與
400nm 吸光值 A2，△A2=A1-A2。
計(jì)算公式
1.甲醇生成量計(jì)算
標(biāo)曲為 y = 0.0298x + 0.009，R2 = 0.9997；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，μmol/mL；y 為吸光值△A1。
甲醇生成量（μmol/g 鮮重）=（ΔA1-0.009） ÷0.0298÷W×V 樣總
=33.56×（ΔA1-0.009）÷W
2.半乳糖醛酸含量計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為 y = 0.2585x - 0.1746，R2 = 0.9986；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，μmol/mL；y 為吸光值△A2。
半乳糖醛酸（μmol/g 鮮重）=(ΔA2+0.1746) ÷0.2585÷W×V 樣總
=3.87×(ΔA2+0.1746)÷W
果膠甲酯化程度（%）=甲醇生成量÷半乳糖醛酸含量×100%
V 樣總：加入提取液體積，1mL；W，樣本質(zhì)量，g
我要詢(xún)價(jià)
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