MycoBlue Kit是針對細胞培養(yǎng)物支原體污染快速檢測的試劑,使用簡便快捷,只需吸取1 μl細胞培養(yǎng)液上清加入反應體 系中,60℃孵育1 h,肉眼觀察即可判定結(jié)果。無需PCR/qPCR儀,無需電泳,在細胞房內(nèi)即可輕松完成。與常用的PCR法 相比MycoBlue Kit對培養(yǎng)液上清中的抑制物耐受度更強,因此不會出現(xiàn)弱陽性、假陰性;反應完成后無需開蓋電泳,避免了 擴增產(chǎn)物氣溶膠造成的假陽性;檢測結(jié)果與目前最靈敏、最準確的qPCR法具有極高的一致性。
經(jīng)驗證,MycoBlue Kit可檢測多達28種支原體,其中包括細胞培養(yǎng)常見的8種支原體;適用于各種懸浮、貼壁培養(yǎng)細 胞,包括CHO 、Vero 、雜交瘤、Sf9 、293等,且具有廣泛的培養(yǎng)基兼容性,因此非常適合于生物制藥企業(yè)、疫苗生產(chǎn)企 業(yè)、單抗生產(chǎn)企業(yè)、 細胞治療/胚胎實驗室以及科研實驗室的日常支原體檢測。
支原體檢測試劑盒(發(fā)光法)產(chǎn)品組分
組 分 | FH8003 (50 rxns) |
MycoBlue Buffer | 1.2 ml |
MycoBlue Enzyme | 50 μl |
Positive Control | 25 μl |
Paraffin Oil | 1.25 ml |
*包含顯色劑。
保存條件
-30 ~ -15℃保存,≤0℃運輸。
自備材料
PCR儀或水浴鍋。
注意事項
試劑保存過程中擰緊管蓋,保持密封。
適用范圍
MycoBlue Kit適用于各種懸浮、貼壁培養(yǎng)細胞,并對培養(yǎng)基、血清種類具有廣泛兼容性。經(jīng)驗證的細胞和培養(yǎng)基血清包 括(但不限于): 懸浮細胞:CHO 、NS0 、293F、小鼠雜交瘤、Sf9 、BHK21 、THP-1 、raji等;
貼壁細胞:Vero 、MDCK 、SP2/0 、293T 、HepG2 、HeLa 、A549 、MB-MDA231 、L929 、MEF等;
培養(yǎng)基:CD FortiCHO 、CDM4 、Expi 293 Medium 、CD Hybridoma 、Grace 、DMEM 、1640 、F12等; 血清:胎牛/小牛血清、馬血清、Gibco KSR血清替代物等。
支原體檢測試劑盒(發(fā)光法)實驗流程
1. 獲得細胞培養(yǎng)液上清
貼壁細胞:直接吸取上清。建議在細胞傳代或換液3天以上,并且匯合度達到90%左右時取樣,此時上清中支原體含量較高,便于檢出。 懸浮細胞:2,300 rpm(500 × g)離心5 min后,吸取上清。建議在細胞傳代或換液3天以上時取樣,此時支原體含量較高,便于檢出。
2. 配制反應體系
將MycoBlue Buffer從-30~ -15℃取出,待解凍后,顛倒混勻。根據(jù)待檢測樣品數(shù)量在微量離心管中配制如下反應體系:
組 分 | 單次反應體積(μl) |
|
MycoBlue Buffer MycoBlue Enzyme | 24 1 | × 樣品數(shù)a × 1.1b |
a.可根據(jù)需要,每次實驗加上一個陰性對照、一個陽性對照;
b.移液器存在移液誤差,建議按照實際反應數(shù)1.1倍配制混合液,以彌補損耗。
用移液器輕輕吹打混勻,分裝到PCR管或微量離心管中,每支反應管25 μl。
3. 加樣
樣品:向反應管中加入1 μl待測培養(yǎng)液上清 陽性對照:加入1 μl Positive Control
陰性對照:不加入任何樣品或加入1 μl Nuclease-free ddH2O
▲如果反應是在水浴鍋中進行,則在每管中加入25 μl Paraffin Oil,以防止液體蒸發(fā)導致結(jié)果不準確。加入Paraffin Oil時請注意更換槍頭,防止樣品之間交 叉污染。
▲如果反應是在PCR儀中進行,不需要加入Paraffin Oil。
4. 反應
將水浴鍋或PCR儀溫度設置成60℃,放入反應管,孵育60 min。
▲水浴鍋實際溫度可能與設置溫度有所偏差,建議先用溫度計進行校準。實際上58 ~ 64℃反應都可以進行,但會影響檢測靈敏度。
▲不建議使用烘箱進行反應。
5. 結(jié)果判定
在一個光線良好的環(huán)境中觀察反應液顏色(建議以白紙為背景)。如果反應液顏色仍為紫色,則判定為支原體陰性;如果反應液顏色變成天 藍色,則判定為支原體陽性。在少數(shù)情況下(如支原體含量較低),反應液顏色可能會介于紫色和天藍色之間,此時可將反應時間持續(xù)延 長到75 - 90 min,如果顏色變?yōu)樘焖{色,則判定為陽性,否則判定為陰性。顏色反應如下圖所示,以陰性對照與陽性對照作為參考。
陰性 陽性
▲反應產(chǎn)物不可開蓋,否則產(chǎn)生的氣溶膠會導致后續(xù)檢測假陽性的出現(xiàn)。建議將反應管包扎在塑料袋或手套中 ,丟棄到專用垃圾桶中,并及時清理。
支原體檢測試劑盒(發(fā)光法)常見問題及解決方案
MycoBlue Kit 的靈敏度是多少?如何保證檢測靈敏度?
MycoBlue Kit 可從1 μl培養(yǎng)液上清中準確檢出至少500 cfu的支原體,即靈敏度為5 × 105 cfu/ml 。通常情況下,培養(yǎng) 液上清中的支原體 含量在106 - 108 cfu/ml之間,該試劑可以滿足絕大多數(shù)實驗的需要。據(jù)文獻報道,單個支原體感染細胞后,在3 - 5天 內(nèi)可增殖至106 cfu/ml 。因此,建議在換液或傳代3天后再進行檢測。
加入培養(yǎng)基上清后,反應液立即變色;或者反應結(jié)束后,反應液顏色呈現(xiàn)紫色與天藍色以外的顏色,是什么原因?如何解決?
在極少數(shù)情況下,培養(yǎng)基成分會對MycoBlue試劑的顏色產(chǎn)生干擾,比如Cell Boost 5(Hyclone)會使MycoBlue試劑呈現(xiàn)出粉紅色。
處理方法:①取少量培養(yǎng)液上清或細胞懸液,2,300 rpm(500 × g)離心5 min,收集上清;②高速離心(>11,200 rpm (12,000 × g))5 min, 使上清中可能存在的支原體沉淀。棄掉大部分上清,保留約50 μl;再加入950 μl Nuclease-free ddH2O,用移液器吹打混勻;③重復 步驟②三次,棄掉大部分上清,保留約50 μl;④取1 μl進行檢測。
操作過程中如何避免出現(xiàn)假陽性?
最重要的是反應結(jié)束后,避免開蓋,否則反應產(chǎn)物會產(chǎn)生氣溶膠污染,導致后續(xù)檢測出現(xiàn)假陽性。另外,加樣時注意更換槍頭, 并將 陽性對照放在最后一管加入,也可以進一步降低假陽性出現(xiàn)的風險。
如果出現(xiàn)支原體污染如何補救?
若發(fā)現(xiàn)細胞存在支原體污染,建議直接丟棄,防止污染其它細胞?蓢L試使用支原體清除劑,對細 胞進行挽救。
MycoBlue Kit 可以檢測多少種支原體?
MycoBlue Kit 可以準確檢出28種支原體:
A. laidlawii* | M. salivarium* | M. neophronis | M. primatum | M. gallinarum | M. lipophilum |
M. hominis* | M. pirum* | M. timone | M. leopharyngis | M. sphenisci | M. falconis |
M. arginini* | M. orale* | M. caviae | M. maculosum | M. bovigenitalium | M. alkalescens |
M. fermentans* | A. granularum | M. alvi | A. oculi | M. auris |
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M. hyorhinis* | A. pleciae | M. bovis | M. iners | M. columbinum |
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*超過95%以上的細胞是被這8種支原體所污染。