正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：海藻糖是由兩個(gè)葡萄糖分子以α ， α- 1- 1 糖苷鍵連接而成的一種非還原雙糖， 廣泛存在于細(xì)菌、酵母菌、霉菌、食用菌、低等植物、昆蟲、 無(wú)脊椎動(dòng)物和高等植物等多種有機(jī)體中。 海藻糖的非還原性決定了它對(duì)酸、堿、高溫等的穩(wěn)定性。 另外， 它本身具有很強(qiáng)的吸水性， 使它在生物體內(nèi)具有抗脫水作用， 在逆境條件下可通過(guò)識(shí)別外界刺激、產(chǎn)生和傳遞信號(hào)、基因表達(dá)和代謝調(diào)節(jié)來(lái)保護(hù)植物免受不良環(huán)境的傷害。植物體內(nèi)主要以葡萄糖為底物合成海藻糖，該反應(yīng)首先在海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase ，TPS）的作用下，催化尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）和 6-磷酸葡萄糖反應(yīng)生成中間產(chǎn)物6-磷酸海藻糖， 再在海藻糖-6-磷酸磷酸酶 （trehalose6-phosphatephosphatase ，TPP）的作用下去磷酸化，生成海藻糖。因此，測(cè)定TPS活性對(duì)于研究植物逆境具有重要意義。
測(cè)定意義：海藻糖是由兩個(gè)葡萄糖分子以α ， α- 1- 1 糖苷鍵連接而成的一種非還原雙糖， 廣泛存在于細(xì)菌、酵母菌、霉菌、食用菌、低等植物、昆蟲、 無(wú)脊椎動(dòng)物和高等植物等多種有機(jī)體中。 海藻糖的非還原性決定了它對(duì)酸、堿、高溫等的穩(wěn)定性。 另外， 它本身具有很強(qiáng)的吸水性， 使它在生物體內(nèi)具有抗脫水作用， 在逆境條件下可通過(guò)識(shí)別外界刺激、產(chǎn)生和傳遞信號(hào)、基因表達(dá)和代謝調(diào)節(jié)來(lái)保護(hù)植物免受不良環(huán)境的傷害。植物體內(nèi)主要以葡萄糖為底物合成海藻糖，該反應(yīng)首先在海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase ，TPS）的作用下，催化尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）和 6-磷酸葡萄糖反應(yīng)生成中間產(chǎn)物6-磷酸海藻糖， 再在海藻糖-6-磷酸磷酸酶 （trehalose6-phosphatephosphatase ，TPP）的作用下去磷酸化，生成海藻糖。因此，測(cè)定TPS活性對(duì)于研究植物逆境具有重要意義。
測(cè)定原理：TPS 催化 UDPG 與 G6P 生成海藻糖-6-磷酸，同時(shí)產(chǎn)生 UDP；UDP 在丙酮酸激酶與乳 酸脫氫酶作用下， 氧化 NADH 為NAD+，NADH 的下降速率與 UDP 含量成正比， 通過(guò) 340nm吸光度下降速率反映 TPS 活性。
需自備的儀器和用品：酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液器、 96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液：液體 100mL×1 瓶， 4℃保存；
試劑一： 粉劑×1 瓶， -20℃保存； 臨用前加入 12mL 試劑五溶解，用不完的試劑分裝后-20℃ 保存，禁止反復(fù)凍融；
試劑二： 粉劑×2 瓶， -20℃保存； 臨用前每瓶加入 10mL 試劑五溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用；
試劑三： 粉劑×1 瓶， -20℃避光保存； 臨用前加入 0.1mL 試劑五溶解，用不完的試劑分裝后 -20℃保存，禁止反復(fù)凍融；
試劑四： 100μL×1 瓶， 4℃避光保存； 臨用前低速離心， 以防止試劑沾在管壁；
試劑五：液體 50mL×1 瓶，4℃保存；
工作液的配制： 臨用前， 先配置好試劑二和試劑三， 然后取試劑二一瓶， 加入 10μL 試劑三 和 10μL 試劑四， 充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。樣品測(cè)定的準(zhǔn)備：
1、細(xì)菌或細(xì)胞的處理：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量 （104 個(gè)）： 提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液）， 超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3S，間隔 10S，重復(fù) 30 次） ；8000g ，4℃離心 10min，取上清， 置冰上待測(cè)。
2、組織的處理：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液） ，冰浴中勻漿。 8000g ，4℃離心 10min，取上清， 置冰上待測(cè)。
測(cè)定步驟
測(cè)定步驟
1 、在 EP 管中加入如下試劑
試劑名稱（μL）測(cè)定管樣本100試劑一100
混勻， 30℃反應(yīng) 20min ，95℃水浴 2min 滅活， 冷卻至室溫。 10000g 4℃離心 5min，取上層 反應(yīng)液待測(cè)。
試劑名稱（μL）測(cè)定管樣本100試劑一100
混勻， 30℃反應(yīng) 20min ，95℃水浴 2min 滅活， 冷卻至室溫。 10000g 4℃離心 5min，取上層 反應(yīng)液待測(cè)。
2、工作液配制：詳見(jiàn)試劑的組成和配制中工作液的配制。3、在 96 孔板中加入如下試劑
反應(yīng)液20工作液180
混勻，測(cè)定 340nm 下反應(yīng) 5min 后的吸光值 A1 與 10min 后的吸光值 A2 ，ΔA=A1-A2。
反應(yīng)液20工作液180
混勻，測(cè)定 340nm 下反應(yīng) 5min 后的吸光值 A1 與 10min 后的吸光值 A2 ，ΔA=A1-A2。
TPS 活力計(jì)算：
1、按照蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化 1nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。
TPS 活力(nmol/min/mg prot)=ΔA×V 反總÷（ ε×d）×109÷（V 樣×Cpr）÷T×10
=1286×ΔA ÷Cpr
2、按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每 g 組織每分鐘催化 1nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。
TPS 活力(nmol/min/g 鮮重)=ΔA×V 反總÷（ε×d）×109÷（W× V 樣÷V 樣總） ÷T×10
=1286×ΔA÷W
3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化 1nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 TPS 活力(nmol/min/104 cell)=ΔA×V 反總÷（ε×d）×109÷（V 樣×細(xì)胞數(shù)量） ÷T×10
=2.57×ΔA
V 反總：反應(yīng)體系總體積， 0.2mL；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)， 6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光徑， 0.5cm；V 樣：加入樣本體積， 0.1 mL；V 樣總： 加入提取液體積， 1 mL；T： 反應(yīng)時(shí)間， 5 min；10，稀釋倍數(shù)； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度， mg/mL；W：樣本質(zhì)量；細(xì)胞數(shù) 量， 500 萬(wàn)。
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