線粒體 DNA 提取的關(guān)鍵是盡可能的去掉核 DNA。本試劑盒利用差速離心得到比較純凈的線粒體,再利用 DNA 酶消化和裂解緩沖系統(tǒng)等多步驟去掉核 DNA,最后得到純凈的線粒體 DNA。可用于 PCR 等對純度要求較高的實驗。
本試劑盒用于從植物葉片中分離出完整而純化的線粒體。適合于田間采摘或者實驗室培養(yǎng)的植物葉片中線粒體 DNA 的提取制備。
試劑存儲
本試劑盒整體保存于 2-8℃一年,Dnase I -20℃保存。使用前,在 DNase I 中加入 600ul(50T)或者 1200ul(100T)的DNA 酶反應液,分裝后-20℃保存三個月,如果超過三個月,活性可能會降低,請自行訂購 DNASE I。線粒體裂解液使用前常溫保存,如有沉淀可 37℃水浴溶解,不影響使用。
使用參考
準備工作: :在 Dnase I 中加入 600ul(50T)或者 1100ul(100T)的 DNA 酶反應液,適當分裝后-20℃保存。線粒體裂解液保存于常溫,如有沉淀 37℃水浴溶解,離心機溫度下降到 4℃(2-8℃),如無低溫離心機,也可以常溫離心,并將離心時間為 10min 的改為 5min,但最后所得 DNA 品質(zhì)及產(chǎn)量可能會有一定影響。
1. 樣本采集前處理:無論田間自然生長還是實驗室組織培養(yǎng),采摘前須避光生長 24-48 小時,以減少葉片組織中糖類及葉綠體含量。取適量植物細胞裂解液,加入 0.5% β-巰基乙醇,如 10ml 植物細胞裂解液加入 50ulβ-巰基乙醇,混勻,形成植物細胞裂解液/β-巰基乙醇溶液,此溶液可 2-8 度保存一個月。
2. 葉片用蒸餾水清洗 2-3 次,濾紙吸干,有條件請用液氮研磨葉片 1-2 克,研磨完后,取 800mg 左右研磨的葉片粉,加入1.5ml 預冷的植物細胞裂解液/β-巰基乙醇溶液,混勻。如果無條件(無液氮),請預冷研缽,取洗過的葉片 1000 mg,用剪刀剪為碎塊放入玻璃勻漿器或者研缽中。加入 1.5ml 預冷的植物細胞裂解液/β-巰基乙醇溶液,冰上研磨至看不見明顯組織塊;
3. 將研磨物放置合適的離心管,4℃,1000× g 離心 5 min;
4. 將上清轉(zhuǎn)移到一新的離心管中,在沉淀中加入 0.5ml 植物細胞裂解液/β-巰基乙醇溶液,混勻,再次 4℃,1000× g 離心5 min,取上清;合并兩次上清,將上清 4℃ 1000× g 再次離心 5 min。
5.取上清,加入一新的離心管中,4℃, 16,000 × g 離心 10 min。離心后的上清含胞漿成分,可從中提取胞漿蛋白。將上清轉(zhuǎn)移到新離心管,線粒體沉淀在管底。
6. 在線粒體沉淀中加入 0.5 mL 線粒體清洗液重懸線粒體沉淀,4℃,1000× g 離心 5 min;
7.取上清,加入一新的離心管中,4℃, 16,000 × g 離心 10 min。棄上清,高純度的線粒體沉淀在管底;
8. 加入 100ul DNA 酶反應液重懸線粒體,吹打均勻后,再加入 10ul DNASE I 溶液(見準備工作),混勻,37℃水浴 10min。此步為消化線粒體表面吸付的核 DNA。4℃, 12,000 × g 離心 5 min。盡可能的棄上清,再加入 200ul TE 重懸線粒體沉淀,4℃,12,000 × g 離心 5 min,洗去殘留的 DNA 酶。
9.得到的沉淀,用 200ul TE 緩沖液重懸線粒體沉淀,加入 10ul RNase A。加入 200ul 線粒體裂解液,輕輕混勻(不可吹打),放置 1-2min,再加入 150ul 蛋白沉淀液,迅速混勻。4℃, 12,000 × g 離心 5 min。此步驟可進一步去除核 DNA。
10.取上清,加入一新的離心管中(如用于酶切分析,可加入此步:選用等體積的酚氯仿異戊醇 25:24:1 抽提一次,再用氯仿抽提一次,或者直接用氯仿抽提兩次,一般來說,此步可去掉一些微量蛋白及糖類,但會造成線粒體 DNA 的損失,因而用于 PCR 時可省,并不影響后續(xù)實驗),加入 0.6 倍體積的異丙醇(如無異丙醇,可加入 2.5 倍體積的乙醇沉淀 DNA,如離心管太滿可分兩管)及 5-10ul 核酸核酸助沉劑,混勻,-20℃沉淀半小時左右(此步可。,4℃, 12,000 × g 離心 10 min。
11. 棄上清,再加入 1ml 70%乙醇清洗,4℃, 12,000 × g 離心 5min。重復用 70%乙醇洗一次。
12. 棄上清,再次離心 1min 吸棄上清,不要碰到管底,開蓋涼干約 5-10min。
13.加入 20-30ul TE 緩沖液,輕彈管底,37℃水浴 5 分鐘,線粒體 DNA 溶解。
14. 進行 DNA 電泳檢測及-20℃保存,進行下步的實驗。(由于部分植物線粒體本身 DNA 含量很低,可以富集多個樣本合并濃縮或進行 PCR 檢測)
注意事項
1. 以離心力 g 計算正確的離心速度,不同的離心機可據(jù)此精確計算離心速度。
2. 進行 Western Blot 和 2D-膠電泳,可直接在第 7 步的沉淀中加入上樣緩沖液裂解線粒體。
3. β-巰基乙醇有毒,請注意通風及防護
附:一般低溫度心機都有離心力顯示,如果沒有,可以用以下公式簡單的換算。
轉(zhuǎn)速與離心力換算
G=1.11×(10 -5 )×R×[rpm] 2
G 為離心力,一般以 g(重力加速度)的倍數(shù)來表示;
[rpm]2 即:轉(zhuǎn)速的平方; R 為半徑,單位為厘米。