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NADH氧化酶(NOX)測試盒微量法

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    意:正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義: 

NOXEC 1.6.99.3)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,可在氧氣存在下,直接將NADH氧化為NAD。該酶不僅參與NAD的再生,而且與免疫反應(yīng)密切相關(guān)。
測定原理:

NOX能夠?qū)?/font>NADH氧化為NAD,NADH的氧化與2,6二氯酚靛藍(DCPIP)的還原相偶聯(lián),藍色的DCPIP被還原為色的DCPIP,在600nm下測定藍色DCPIP的還原速率計算出NADH氧化酶活性的大小。
需自備的儀器和用品

可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰、蒸餾水
試劑的組成和配制:

試劑一液體50mL×1瓶,-20℃保存。

試劑二液體10mL×1瓶,-20℃保存。

試劑三液體1mL×1瓶,-20℃保存。

試劑四液體50mL×1瓶,4℃保存。

試劑五液體6 mL×1瓶,4℃保存。

試劑六粉劑×2瓶,-20℃保存;臨用前每瓶加入5mL蒸餾水用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融
樣本的前處理:

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

① 準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬細(xì)胞,加入1mL試劑一10uL 試劑三,冰浴勻漿器或研缽勻漿。

② 將勻漿600g4℃離心5min。

③ 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心10min

④ 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測定從線粒體泄漏的NOX(此步可選做)

⑤ 步驟④中的沉淀即為線粒體,加入200uL試劑二2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10秒,重復(fù)30次),用于NOX活性測定血清(漿)樣品:直接檢測。

測定步驟

1、 分光光度計預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至600nm,蒸餾水調(diào)零。

2、 樣本測定

1)試劑四、試劑五和試劑六于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)孵育5min

2)在1mL石英比色皿中加入40μL樣本、700μL試劑四、100μL試劑五和160μL試劑六,混勻,記錄600nm20s時吸光值A11min20s后的吸光值A2計算ΔA=A1-A2。

NOX活力單位的計算

1、血清(漿)NOX活力的計算:

單位的定義:每mL血清(漿)在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個酶活力單位。

NOXU/mL)=ΔA×V反總÷V÷0.01÷T=2500×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NOX活力的計算:

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個酶活力單位。

NOXU/mg prot=ΔA×V反總÷V×Cpr÷0.01÷T=2500×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織在mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個酶活力單位。

NOXU/g 鮮重)=ΔA×V反總÷(W× V÷V樣總0.01÷T=505×ΔA÷W

3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞在mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個酶活力單位。

NOXU/104 cell=ΔA×V反總÷(500×V÷V樣總0.01÷T=1.01×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,1mL; V樣:加入樣本體積,0.04mL;V樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應(yīng)時間,1 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬。

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