注 意:正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義:
MDH (EC 1.1.1.37)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,線粒體中MDH是TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶之一,催化蘋果酸形成草酰乙酸;相反,胞漿中MDH催化草酰乙酸形成蘋果酸。草酰乙酸是重要的中間產(chǎn)物, 連接多條重要的代謝途徑。因此,MDH在細(xì)胞多種生理活動中扮演著重要的角色,包括線粒體的能量代謝、 蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)、活性氧代謝和抗病性等。根據(jù)不同的輔酶特異性,MDH分為NAD-依賴的MDH和NADP-依賴的MDH,細(xì)菌中通常只含有NAD-MDH,在真核細(xì)胞中,NAD-MDH分布于細(xì)胞質(zhì)和線粒體中。
測定原理:
NAD-MDH催化NADH還原草酰乙酸生成蘋果酸,導(dǎo)致340nm處光吸收下降。
需自備的儀器和用品:
紫外分光光度計(jì)、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1 mL石英比色皿和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
試劑一、提取液60 mL×1瓶,在4℃保存;
試劑二、液體50 mL×1瓶,在4℃保存;
試劑三、粉劑×2支,-20℃保存;臨用前加入300μL蒸餾水,充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
試劑四、粉劑×2支,-20℃保存;臨用前加入300μL蒸餾水,充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
樣本測定的準(zhǔn)備:
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:
組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2、血清(漿)樣品:直接檢測。
測定步驟:
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 將試劑二在37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴10min以上。
3、 操作表:
將上述試劑按順序加入1 mL石英比色皿中,混勻后立即在340 nm波長下記錄初始吸光度A1和反應(yīng)1min后的吸光度A2,計(jì)算ΔA=A1-A2。
注意:若A1-A2大于0.5,需將樣本用提取液稀釋,使A1-A2小于0.5,可提高檢測靈敏度。計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
NAD-MDH活力單位的計(jì)算:
1、血清(漿)NAD-MDH活力的計(jì)算
單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
NAD-MDH(nmol/min/mL)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=6430×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NAD-MDH活力的計(jì)算:
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
NAD-MDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算:
單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
NAD-MDH(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T =6430×ΔA÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
單位的定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
NAD-MDH(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(2000×V樣÷V樣總)÷T=3.215×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,8×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.02mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,1 min;W:樣本質(zhì)量,g;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;2000:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),2000萬。