注 意:正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義:
甲醛是一種能與蛋白質(zhì)、核酸和脂類產(chǎn)生非特異性反應(yīng)的活潑化合物,對所有生物都具有很高毒性。甲醛脫氫酶作為含鋅中等鏈醇脫氫酶(ADH)的家庭成員之一,廣泛存在于原核和真核生物中,該酶能利用NAD+作為輔酶,將有毒的甲醛氧化,是甲醛氧化途徑中的關(guān)鍵酶。
測定原理:
甲醛脫氫酶催化甲醛和NAD+產(chǎn)生NADH,在340nm處的吸光值會增加,測定340nm處的吸光值變化,可計算得到甲醛脫氫酶的活性。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器:
天平、離心機(jī)、分光光度計、1mL玻璃比色皿、蒸餾水。
試劑組成和配制:
提取液:液體60mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:液體30mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:粉劑×1瓶,-20℃保存;臨用前加入15mL水溶解待用,用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
試劑三:粉劑×1瓶,4℃保存;臨用前加入3mL水溶解待用。
試劑四:液體3mL×1瓶,4℃避光保存。
FDH提。
1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進(jìn)行冰浴勻漿,然后10000g,4℃,離心20min。
2. 細(xì)胞:按照細(xì)胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后10000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。
3. 液體:直接檢測。
測定操作表:
1、 分光光度計預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 操作表
在比色皿中加入如下試劑
| 測定管 |
樣本(µL) | 100 |
試劑一(µL) | 550 |
試劑二(µL) | 250 |
試劑三(µL) | 50 |
試劑四(µL) | 50 |
混勻,于340nm下測定初始吸光值A1與5min后的吸光值A2,△A=A2-A1。
若樣本數(shù)量較多,可將試劑按比例配成工作液使用。
FDH酶活計算:
(1)按蛋白濃度計算
酶活定義:每毫克蛋白每分鐘催化還原1nmol NAD+的酶量為1個酶活單位。
(2)按樣本質(zhì)量計算
酶活定義:每克樣品每分鐘催化還原1nmol NAD+的酶量為1個酶活單位。
(3)按照細(xì)胞數(shù)量計算
酶活定義:每104個細(xì)胞每分鐘催化還原1nmol NAD+的酶量為1個酶活單位。
(4)按液體體積計算
酶活定義:每mL樣本每分鐘催化還原1nmol NAD+的酶量為1個酶活單位。
:NADH微摩爾消光系數(shù),6.22×10-3 L/µmol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V反總:反應(yīng)體系總體積,1mL;V樣:反應(yīng)體系中樣本體積,0.1mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;T,反應(yīng)時間,5min;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g