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NADP-蘋果酸脫氫酶(NADP-MDH)測(cè)試盒

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    意:正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義:

MDH EC 1.1.1.37)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,線粒體中MDHTCA循環(huán)的關(guān)鍵酶之一,催化蘋果酸形成草酰乙酸;相反,胞漿中MDH催化草酰乙酸形成蘋果酸。草酰乙酸是重要的中間產(chǎn)物, 連接多條重要的代謝途徑。因此,MDH在細(xì)胞多種生理活動(dòng)中扮演著重要的角色,包括線粒體的能量代謝、 蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)、活性氧代謝和抗病性等。根據(jù)不同的輔酶特異性,MDH分為NAD-依賴的MDHNADP-依賴的MDH, NADP-MDH主要存在于真核細(xì)胞中。


測(cè)定原理:

NADP-MDH催化NADPH還原草酰乙酸生成蘋果酸,導(dǎo)致340nm處光吸收下降。


自備的儀器和用品:

紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1 mL石英比色皿和蒸餾水。


試劑的組成和配制:

試劑一、提取液60 mL×1瓶,在4保存;

試劑二、液體50 mL×1瓶,在4保存;

試劑三、粉劑×2支,-20保存;臨用前300μL蒸餾;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

試劑四、粉劑×2支,-20保存;臨用前300μL蒸餾用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。


樣本測(cè)定的準(zhǔn)備:

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL試劑一),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4離心10min,取上清置冰上待測(cè)。

組織:按照組織質(zhì)量(g:試劑一體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

2、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。


測(cè)定步驟

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm,蒸餾水調(diào)零。

2、 試劑二在37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)水浴10min以上。

3、 操作表:

試劑名稱μL

測(cè)定孔

樣本

20

試劑二

760

試劑三

10

試劑四

10

將上述試劑按順序加入1 mL石英比色皿中,混勻后立即在340 nm波長(zhǎng)下記錄初始吸光度A1反應(yīng)1min的吸光度A2,計(jì)算ΔA=A1-A2。

注意:A1-A2大于0.5,需將樣本用提取液稀釋,使A1-A2小于0.5,可提高檢測(cè)靈敏度。計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

 

NADP-MDH活力單位的計(jì)算:

1、血清(漿)NADP-MDH活力的計(jì)算

單位的定義:每升血清(漿)每分鐘消耗1 nmolNADPH定義為一個(gè)酶活力單位。 

NADP-MDHnmol/min/mL=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷V÷T=6430×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NADP-MDH活力的計(jì)算:

1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmolNADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-MDHnmol/min/mg prot=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計(jì)算:

單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmolNADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-MDHnmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109W ×V÷V樣總)÷T =6430×ΔA÷W

3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:

單位的定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmolNADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-MDHnmol/min/104 cell=[ΔA×V反總÷ε×d×109V÷V樣總×500÷T=12.86×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,8×10-4 L;εNADPH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.02 mL;V樣總:加入提取液體積1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1 min;W:樣質(zhì)量,g;Cpr樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬(wàn)。

 

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