注 意:正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義:
NADPase主要存在于植物組織中,是生物體內(nèi)唯一催化NADP+降解為NAD+的酶,與NADK一起調(diào)控NAD和NADP之間的平衡。
測定原理:
NADPase能夠催化NADP+水解為NAD+和無機(jī)磷的反應(yīng),通過測定無機(jī)磷的量來測定NADPase活性。
所需的儀器和用品:
可見分光光度計、恒溫水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水
試劑的組成和配制:
提取液:60mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:液體30 mL×1瓶, 4℃保存。
試劑二:粉劑×5支,-20℃保存;用時每支加入1 mL試劑一充分溶解備用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
試劑三:粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時加入25mL蒸餾水,溶解后4℃可保存一周。
試劑四:粉劑×1瓶, 4℃保存。用時加入25mL蒸餾水,溶解后4℃可保存一周。
試劑五:液體 25mL×1 瓶,室溫保存。
試劑六:10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 10mL×1 瓶,4℃保存。
0.5μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制:將試劑六20倍稀釋,即取 0.5mL試劑六加9.5蒸餾水,充分混勻。
定磷試劑的配制:按H2O: 試劑三:試劑四:試劑五=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷試劑
應(yīng)為淺黃色,若無色則試劑失效,若是藍(lán)色則為磷污染,定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。
注 意:配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。
樣本的前處理:
按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
操作步驟:
1、酶促反應(yīng)
試劑名稱(μL) | 測定管 | 對照管 |
試劑一 | 300 | 300 |
試劑二 | 100 | 100 |
37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)預(yù)熱5min
樣本 | 100 |
|
蒸餾水 |
| 100 |
37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)準(zhǔn)確反應(yīng)30min后,95℃水浴5min(蓋緊,以防止水分散失),冷卻后,10000g 25℃離心5min,取上清
2、定磷
| 標(biāo)準(zhǔn)管 | 空白管 | 測定管 | 對照管 |
0.5μmol/ml標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液 | 100 |
|
|
|
蒸餾水 |
| 100 |
|
|
上清液 |
|
| 100 | 100 |
定磷試劑 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
混勻,37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴30min,冷卻至室溫,在 660nm處,蒸餾水調(diào)零,記錄各管吸光值。
注意事項:
1、此法具有微量、靈敏、快速的特點。所以對測定所用試管要求嚴(yán)格,要沒有一點磷,若試管放過磷酸或磷酸鹽緩沖液,一定要洗得非常干凈,要先用洗潔精加水煮,再用自來水沖,最后用蒸餾水沖干凈。最好用一次性塑料管或新玻璃管,避免磷污染是檢測成敗的關(guān)鍵。
2、標(biāo)準(zhǔn)管、空白管和對照管只要做一次即可。
NADPase酶活性計算:
1、按組織蛋白濃度計算:
定義:每小時每毫克組織蛋白NADPase分解NADP 產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個 NADPase活力單位。
NADPase (μmol/h/mg prot)=(C標(biāo)準(zhǔn)管×V總)×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷
(V樣×Cpr)÷T=5×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr
2、按樣本鮮重計算:
定義:每小時每g組織NADPase分解NADP 產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個 NADPase活力單位。
NADPase (μmol/h/g鮮重)=(C標(biāo)準(zhǔn)管×V總)×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×
V總÷(W× V樣÷V樣總)÷T=5×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W
C標(biāo)準(zhǔn)管:標(biāo)準(zhǔn)管濃度,0.5μmol/mL;V總:酶促反應(yīng)總體積,0.5mL;V樣:加入樣本體積,0.1mL ;V樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時間,0.5小時;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g。