注 意:正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義:
ME廣泛存在于微生物、培養(yǎng)細(xì)胞、動(dòng)物和植物胞漿中,尤其在植物組織中活性較高。ME催化蘋果酸氧化脫羧的可逆反應(yīng),產(chǎn)生丙酮酸和CO2,以及伴隨NAD(P)+的還原反應(yīng),是蘋果酸代謝的關(guān)鍵酶。ME活性與生物合成和抗氧化密切相關(guān)。近年來植物ME活性測定較多,已經(jīng)成為抗氧化研究的熱點(diǎn)。根據(jù)輔酶專一性和對底物特異性的不同,可將ME分為NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。
測定原理:
NADP-ME催化NADP+還原成NADPH,在340nm下測定NADPH增加速率。
需自備的儀器和用品:
紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL石英比色皿和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
提取液:60mL×1瓶,4℃保存。;
試劑一:液體60mL×1瓶,4℃保存;
試劑二:粉劑×1瓶,-20℃保存; 臨用前加入50mL試劑一充分振蕩,溶解待用,用不完的試劑分裝后-20度保存,禁止反復(fù)凍融。
試劑三:粉劑×1瓶,-20℃保存;臨用前加入6mL蒸餾水充分振蕩,溶解待用,用不完的試劑分裝后-20度保存,禁止反復(fù)凍融。
樣本的前處理:
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);14000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。14000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2、血清(漿)樣品:直接檢測。
測定步驟:
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。
2、在1mL石英比色皿中加入50μL樣本和850μL試劑二,混勻,30℃孵育5min,加入100μL試劑三,混勻后立即記錄340nm處初始吸光值A1和 1min后的吸光值A2,計(jì)算ΔA=A2-A1。
NADP-ME活性計(jì)算:
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。
NADP-ME(nmo/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T= 3215×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
(2)按樣本鮮重計(jì)算:
單位的定義:每g組織每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。
NADP-ME(nmo/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T =3215×ΔA÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
單位的定義:每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。
NADP-ME(nmo/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T =6.43×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,1×10-3 L;ε:NADPH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.1 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。