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β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase, β-GAL)試劑盒

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β-半乳糖苷酶β-Galactosidase, β-GAL)試劑盒說明書

                              分光光度法50/24

 

    正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義:                           

β-GAL(EC 3.2.1.23)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,能夠催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷鍵水解,此外還具有轉(zhuǎn)半乳糖苷的作用。β-GAL不僅可為植物的快速生長釋放儲(chǔ)存的能量,還能在正常的多糖代謝、細(xì)胞壁組分代謝以及衰老時(shí)細(xì)胞壁降解過程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖殘基的水解,釋放自由的半乳糖。

 

測定原理:

β-GAL分解對-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成對-硝基苯酚,后者在400nm有最大吸收峰,通過測定吸光值升高速率來計(jì)算β-GAL活性。


自備用品

可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰蒸餾水。

 

試劑組成和配制

提取液:液體50mL×1瓶,4保存

試劑粉劑×1瓶,-20保存;臨用前每瓶加入5mL蒸餾水,充分溶解備用;用不完的試劑仍-20保存。

試劑二:液體15mL×1瓶,4保存

試劑:液體50mL×1瓶,4保存。


粗酶液提取

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液,超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);15000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

2、組織:按照組織質(zhì)量(g:提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

3、培養(yǎng)液等液體樣本:直接檢測。


測定步驟:

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至400nm,蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定(在EP管中依次加入下列試劑):

試劑名稱(μL

測定管

對照管

試劑一

200

 

蒸餾水

 

200

試劑二

250

250

樣本

50

50

迅速混勻,放入37準(zhǔn)確水浴30min

試劑三

1000

1000

充分混勻,400nm處測定吸光值A,計(jì)算ΔA=A測定-A對照。每個(gè)測定管需設(shè)一個(gè)對照管。

 

β-GAL活性計(jì)算:

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y =0.00543x -0.0027;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(nmol/mL),y吸光值。

1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

β-GAL活力(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V反總]÷(V×Cpr)÷T

=61.39×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

2)按樣本鮮重計(jì)算:

單位的定義:每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

β-GAL活力(nmol/min /g鮮重)[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V反總]÷(W×V÷V樣總)÷T

=61.39×(ΔA+0.0027) ÷W

3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:

單位的定義:每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1nmol-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

β-GAL活力(nmol/min /104 cell)=[(ΔA+0.0027) ÷0.00543×V反總]÷(500×V÷V樣總)÷T

=0.123×(ΔA +0.0027)

4)按液體體積計(jì)算:

單位的定義:每mL液體樣本每分鐘產(chǎn)生1nmol-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

β-GAL活力(nmol/min /mL)[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V反總]÷V÷T

=61.39×(ΔA+0.0027)

V反總:反應(yīng)體系總體積,0.5mL;V樣:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.05mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣質(zhì)量,g; 500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500;T:反應(yīng)時(shí)間,30min。

 

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