注 意:正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義:
ICDHc(EC 1.1.1.42)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中,催化異檸檬酸脫氫脫羧生成 α-酮戊二酸,同時還原NADP+生成NADPH。ICDHc是細胞質(zhì)中除了磷酸戊糖途徑外又一種NADPH重要來源,在逆境中該酶活性通常會發(fā)生顯著變化。
測定原理:
利用ICDHc催化NADP+還原成NADPH反應,在340 nm下測定NADPH濃度的增加。
所需的儀器和用品:
紫外分光光度計、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1 mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
提取液:60mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體50 mL×1瓶,4℃保存;
試劑二:粉劑×1支,4℃保存;
試劑三:粉劑×1支,4℃保存;
試劑四:粉劑×1支,-20℃保存;
樣本的前處理:
1、細菌、細胞或組織樣品的制備:
細菌或培養(yǎng)細胞:先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細菌或細胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2、血清(漿)樣品:直接檢測。
測定步驟:
1、 分光光度計預熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 將試劑二轉(zhuǎn)移至試劑一中充分溶解,置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴中預熱10min左右;用不完的試劑4℃保存。
3、 在試劑三中加入550μL蒸餾水充分溶解,置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴中預熱10min左右;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。
4、 在試劑四中加入550μL蒸餾水充分溶解,置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴中預熱10min左右;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。
5、 操作表:
試劑名稱(μL) | 測定管 |
試劑一 | 750 |
試劑三 | 10 |
試劑四 | 10 |
樣本 | 30 |
將上述試劑按順序加入1 mL石英比色皿中,加樣本的同時開始計時;混勻,在340nm波長下記錄20s時的初始吸光度A1和2min20s時的吸光度A2,計算ΔA=A2-A1。