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注 意:正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義:
GST是一種具有多種生理功能的蛋白質(zhì)家族,主要存在于細胞質(zhì)內(nèi)。GST是體內(nèi)解毒酶系統(tǒng)的重要組成部分,主要催化各種化學(xué)物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物與GSH的巰基共價結(jié)合,使親電化合物變?yōu)橛H水物質(zhì),易于從膽汁或尿液中排泄,達到將體內(nèi)各種潛在或具備毒性的物質(zhì)降解并排出體外的目的。因此,GST在保護細胞免受親電子化合物的損傷中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。此外,因為GST具有GSH-Px活性,亦稱為non-Se GSH-Px,具有修復(fù)氧化破壞的大分子如DNA、蛋白質(zhì)等的功能。注意,GST催化的反應(yīng)減少GSH含量,但是不增加GSSG含量。
測定原理:
GST催化GSH與CDNB結(jié)合,其結(jié)合產(chǎn)物的光吸收峰波長為340nm;通過測定340nm波長處吸光度上升速率,即可計算出GST活性。
自備儀器和用品:
紫外分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、1mL石英比色皿和蒸餾水。
試劑組成和配置:
試劑一:液體50mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:液體45mL×1瓶,4℃保存。
試劑三:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加5 mL蒸餾水溶解。
粗酶液提取:
1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿。8000g,4℃離心10min,取上清置冰上待測。
2. 細菌、真菌:按照細胞數(shù)量(104個):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后8000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。
3. 血清等液體:直接測定。
測定操作:
1. 分光光度計預(yù)熱30 min,調(diào)節(jié)波長到340 nm,用蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑三放在25℃(一般物種)或者37℃(哺乳動物)保溫。
3. 測定管:取1mL石英比色皿,加入100μL上清液,900μL試劑二和100μL試劑三,迅速混勻后于340nm測定吸光度變化,記錄10 s和310 s吸光度為A1和A2。