注 意 ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：
L-半乳糖途徑是合成AsA的主要途徑。Gal LDH位于線粒體內(nèi)膜，負(fù)責(zé)催化植物體內(nèi)AsA生物合成的最后一步，也是該途徑的關(guān)鍵酶之一，對(duì)植物體內(nèi)AsA含量的積累起著至關(guān)重要的作用。
測(cè)定原理：
Gal LDH催化L-半乳糖內(nèi)酯還原細(xì)胞色素c（Cyt c），還原型Cyt c在550nm有吸收峰；測(cè)定還原型Cyt c增加速率，來(lái)計(jì)算Gal LDH活性。
自備儀器和用品：
臺(tái)式離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)、1mL玻璃比色皿、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體50mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入40mL蒸餾水，充分溶解。
試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入5mL蒸餾水，充分溶解。
粗酶液提�。�
按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。13000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。
Gal LDH測(cè)定操作：
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到550nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑二在25℃水浴鍋中預(yù)熱30 min。
3. 依次在1mL玻璃比色皿中加入100μL上清液、800μL預(yù)熱的試劑二和100μL試劑三，迅速混勻后于550nm比色，記錄10s和130s的吸光值A1和A2，△A = A2﹣A1。
Gal LDH活性計(jì)算公式：
(1). 按蛋白濃度計(jì)算
Gal LDH活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘還原1nmol Cyt c 為1個(gè)酶活單位。
Gal LDH (nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V反總×109÷（Cpr×V樣）÷T
=289×△A ÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算
Gal LDH活性單位定義：25℃中每克樣品每分鐘還原1nmol Cyt c 為1個(gè)酶活單位。
Gal LDH (nmol/min/g鮮重) = △A÷ε÷d×V反總×109÷（W×V樣÷V樣總）÷T
=289×△A ÷W
ε：還原型Cyt c摩爾消光系數(shù)，17.3×103L/ mol/cm；d：比色皿光徑(cm)，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，1mL=0.001 L；109：1mol=1×109nmol；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，100μL=0.1mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，蛋白質(zhì)濃度需要另外測(cè)定，建議使用本公司蛋白質(zhì)含量BCA試劑盒；V樣總：加入提取液體積，1mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，2min。
