注 意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：
蛋白質(zhì)羰基是多種氨基酸在蛋白質(zhì)的氧化修飾過程中的早期標(biāo)志，其含量高低表明蛋白質(zhì)氧化損傷程度的大小，是衡量蛋白質(zhì)氧化損傷的主要指標(biāo)。
測(cè)定原理：
羰基與2,4-二硝基苯肼反應(yīng)生成紅色2,4-二硝基苯腙，在370nm處有特征吸收峰。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：
天平、恒溫水浴鍋、低溫離心機(jī)、漩渦震蕩儀、可見分光光度計(jì)、1 mL玻璃比色皿和蒸餾水，無水乙醇，乙酸乙酯。
試劑組成和配制：
提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：粉劑0.1g×5支，4℃避光保存。（使用前根據(jù)樣品數(shù)，每支加1mL水溶解，每支為10個(gè)樣品用量）
試劑二：液體20mL×1瓶，4℃避光保存。
試劑三：液體20mL×1瓶，4℃保存。
試劑四：液體25mL×1瓶，4℃保存。
試劑五：根據(jù)測(cè)定樣品量，將乙酸乙酯和無水乙醇等體積混合。
試劑六：液體100mL×1瓶，4℃保存。
樣品處理：
1. 組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，于4℃，4000g離心10min，取上清，加入0.1mL試劑一，室溫放置10min，4℃，10000g離心10min，取上清待測(cè)。
2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。
3. 血清等液體樣本：直接測(cè)定。
測(cè)定步驟和操作表：
|
| 對(duì)照管 | 測(cè)定管 |
| 樣品（mL） | 0.2 | 0.2 |
| 試劑二（mL） |
| 0.4 |
| 試劑三（mL） | 0.4 |
|
| 混勻，37℃避光反應(yīng)1h | ||
| 試劑四（mL） | 0.5 | 0.5 |
| 靜置5min，4℃，12000g離心15min，棄上清，留沉淀 | ||
| 試劑五（mL） | 1.0 | 1.0 |
| 漩渦混勻，4℃，12000g離心10min，棄上清，留沉淀 | ||
| 試劑五（mL） | 1.0 | 1.0 |
| 漩渦混勻，4℃，12000g離心10min，棄上清，留沉淀 | ||
| 試劑五（mL） | 1.0 | 1.0 |
| 漩渦混勻，4℃，12000g離心10min，棄上清，留沉淀 | ||
| 試劑六（mL） | 1.0 | 1.0 |
| 漩渦混勻，37℃溫育15min，沉淀全部溶解后，4℃，12000g離心15min，取上清，1mL玻璃比色皿，試劑六調(diào)零，分別記錄370nm對(duì)照管和測(cè)定管在的吸光值，ΔA370 =A370測(cè)定管－A370對(duì)照管 | ||
計(jì)算公式：
1. 按照樣本蛋白濃度計(jì)算
蛋白質(zhì)羰基含量（μmol/mg prot）= [ΔA370×V反總÷（ε×d）]÷(V樣×Cpr) =0.227×ΔA370÷Cpr
2. 按照樣本重量計(jì)算
蛋白質(zhì)羰基含量（μmol/g 鮮重）= [ΔA370×V反總÷（ε×d）]÷(W ×V樣÷V樣總) =0.227×ΔA370÷W
3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
蛋白質(zhì)羰基含量（μmol/104cell）= [ΔA370×V反總÷（ε×d）]÷(細(xì)胞數(shù)量 ×V樣÷V樣總) =0.227×ΔA370÷細(xì)胞數(shù)量
4. 按照液體體積計(jì)算
蛋白質(zhì)羰基含量（μmol/mL）= [ΔA370×V反總÷（ε×d）]÷V樣=0.227×ΔA370
V反總：反應(yīng)體系總體積，1mL；ε：羰基微摩爾消光系數(shù)，22×10-3 L/μmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.2 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，W：樣本質(zhì)量，g
