注 意:正式測(cè)定前取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義:
單寧是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的多元酚化合物,又稱植物多酚。具有獨(dú)特的化學(xué)性質(zhì)和多種生理活性,如能與蛋白質(zhì)、生物堿、多糖結(jié)合;能與多種金屬離子發(fā)生絡(luò)合或靜電作用;具有止血、抑制微生物、抗過(guò)敏、抗突變、抗腫瘤、抗衰老等生理活性。
測(cè)定原理:
單寧在堿性環(huán)境下與磷鉬酸反應(yīng),生成藍(lán)色化合物,在760nm處有最大吸收峰。
需自備的儀器和用品:
可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
試劑一:液體10 mL× 1瓶,4℃保存;
試劑二:液體8 mL × 1瓶,4℃保存;
單寧的提。
按照組織質(zhì)量(g):蒸餾水體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL蒸餾水),充分勻漿后轉(zhuǎn)移到EP管中,80℃水浴提取30min, 8000 g,25℃離心10 min,取上清液待測(cè)。
測(cè)定步驟:
1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至760nm,蒸餾水調(diào)零;試劑一和試劑二37℃預(yù)熱10min以上;
2、操作表:
試劑名稱(µL) | 對(duì)照管 | 測(cè)定管 |
樣本 |
| 25 |
蒸餾水 | 675 | 650 |
試劑一 | 175 | 175 |
混勻,室溫靜置5min
試劑二 | 150 | 150 |
混勻,室溫靜置30min,760nm處讀取吸光值A,ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照,對(duì)照管只要做一管。
單寧含量計(jì)算:
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 1.6418x +0.0134;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL),y為ΔA(A測(cè)定-A對(duì)照)。
2、按樣本鮮重計(jì)算:
單寧含量(mg /g鮮重)= [(ΔA-0.0134) ÷1.6418×V1]÷(W×V1÷V2)=0.609×(ΔA-0.0134) ÷W。
3、按樣本蛋白濃度計(jì)算:
單寧含量(mg/mg prot)= [(ΔA-0.0134) ÷1.6418×V1]÷(V1×Cpr)=0.609×(ΔA-0.0134) ÷Cpr。
V1:加入樣本體積,0.025mL;V2:加入提取液體積,1mL; Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g。